circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1ZC3H12A-Dependent Ubiquitination.

circRNA通过HECTD1/ZC3H12A依赖性泛素化介导二氧化硅诱导的巨噬细胞活化

期刊：Theranostics；影响因子：8.537

发表单位：东南大学 

    ZC3H12A可结合并稳定circHECTD1分子，在SiO2的刺激下，circHECTD1的表达显著下降，使得HECTD1得以保留和增高，介导了ZC3H12A的泛素化降解作用，引起巨噬细胞M1型活化状态和肺纤维化等病理进程。

    二氧化硅（SiO₂）向肺细胞的吞噬作用引起炎症级联，导致成纤维细胞增殖和迁移，随后出现纤维化。通过研究健康供者和患者以及RAW264.7巨噬细胞系的肺泡巨噬细胞原代培养物用于探讨circHECTD1（HECT结构域E3泛素蛋白连接酶1）在巨噬细胞活化中的功能。结果表明，SiO₂降低了circHECTD1水平，同时增加了HECTD1蛋白表达；circHECTD1和HECTD1通过泛素化参与SiO₂诱导的巨噬细胞活化；SiO₂激活的巨噬细胞通过circHECTD1/HECTD1通路促进成纤维细胞的增殖和迁移。

    矽肺病是一种职业病，由长期暴露于高含量含有过量的游离二氧化硅（结晶二氧化硅）的粉尘引起，发病率表现出个体间的差异，这可能是由于个体炎症反应的变化。通过肺泡巨噬细胞对二氧化硅颗粒的吞噬作用引发矽肺病。这些巨噬细胞释放出各种氧化剂和细胞因子，它们在疾病的发展和进展中起着至关重要的作用。因此，需要研究circRNA在炎症和纤维化的进展和治疗中的作用。

    在本研究中，我们对已建立的SiO₂诱导的矽肺小鼠模型进行了circRNA微阵列分析。如图A所示，通过层次聚类显示，circRNA在生理盐水（NS）和SiO₂处理的小鼠的肺中表达。我们鉴定了与NS组相比在SiO₂组中差异表达的120种circRNA，其中有73个上调，47个下调。mmu_circ_0000375特别令人感兴趣，因为其宿主基因HECTD1（候选E3泛素连接酶）可能通过遍在蛋白化参与SiO₂诱导的炎症和纤维化。如图1B-C中所示的火山和散点图所示，在NS组和SiO₂组中小鼠的肺中circHECTD1表达不同。

    肺泡巨噬细胞（AMO）是矽肺的效应细胞，因此，在小鼠RAW264.7巨噬细胞中测量SiO₂对circHECTD1表达的影响。通过使用趋异引物的qRT-PCR实验观察到在RAW264.7细胞暴露于SiO₂ 24小时后，circHECTD1表达降低。这些结果在荧光原位杂交（FISH）测定中得到证实，其中circHECTD1主要在RAW264.7细胞的细胞质中检测到。随后通过检测SiO₂处理的小鼠BALF分离的巨噬细胞中的circHECTD1水平证实了circHECTD1表达的降低。

    将circHECTD1慢病毒转染到RAW264.7细胞中使其过表达，RAW264.7细胞中circHECTD1的转染恢复了暴露于SiO₂ 48小时诱导的细胞活力的降低。在SiO₂处理的RAW264.7细胞中测量巨噬细胞的各种表型标志物的水平，例如NOS2（M1），ARG1（M2a）和SOCS3（M2c），发现SiO₂诱导NOS2，ARG2和SOCS3表达的显著增加。用circHECTD1慢病毒转染减弱了用SiO₂处理的巨噬细胞的表型转化，消除了SiO₂诱导的RAW264.7细胞迁移的增加，证实了circHECTD1在SiO₂诱导的巨噬细胞活化中的作用。

    之前已表明ZC3H12A/MCPIP1可介导巨噬细胞活化和成纤维细胞增殖/迁移，尚不清楚circHECTD1是否可以介导ZC3H12A影响巨噬细胞活化。ZC3H12A质粒减弱了由SiO₂诱导的M1和M2标记物的增加，而ZC3H12A siRNA加剧了由SiO₂诱导的M1和M2标记物的增加。此外，我们采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）测定来确定circHECTD1和ZC3H12A之间是否存在相关性，结果表明ZC3H12A与circHECTD1相互作用但不与HECTD1 mRNA相互作用。

    我们首先检测在SiO₂处理的RAW264.7细胞中HECTD1蛋白的水平，发现其呈现快速且持续的增加，免疫染色证实了这一发现。此外，HECTD1 mRNA的水平显示出快速和瞬时的增加并且在SiO₂暴露后3小时达到峰值。随后我们建立小鼠矽肺模型，免疫组织化学分析揭示了肺中巨噬细胞的积累，如特异性巨噬细胞标记物F4/80的增加所示，表明发生了炎症级联反应。在SiO₂暴露后HECTD1表达在小鼠肺中上调，并且HECTD1与巨噬细胞标记物F4/80的共定位也增加，证实了先前的发现。

    用circHECTD1慢病毒转染RAW264.7细胞不影响HECTD1 mRNA水平但却抑制了HECTD1蛋白的表达，突出了circHECTD1和HECTD1之间的联系。基于CRISPR/Cas9系统，用HECTD1 CRISPR激活质粒（ACT）转染和用CRISPR双切口酶质粒（NIC）转染分别上调和下调HECTD1的表达。ACT增加ARG1和SOCS3的表达但不增加NOS2，而NIC增加NOS2表达并降低ARG1和SOCS3的表达，HECTD1被认为参与由SiO₂诱导的circHECTD1介导的表型变化。ACT治疗也降低了RAW264.7细胞的活力，而NIC治疗恢复了它们的生存能力。

    免疫沉淀测定揭示了HECTD1和ZC3H12A之间的相互作用。通过检测蛋白酶体抑制剂MG-132对ZC3H12A的作用，发现RAW264.7细胞的存活率以剂量依赖性方式降低。此外，ZC3H12A表达在生理暴露于MG-132后升高，但在SiO₂处理后未升高。随后，检测HECTD1对K48-遍在蛋白表达的影响。HECTD1的过表达增强了K48-遍在蛋白的表达。HECTD1敲低减弱了K48-遍在蛋白的表达，而对ZC3H12A表达的作用与K48-遍在蛋白的作用相反。此外，circHECTD1慢病毒的转染降低了K48-遍在蛋白的表达。

    接下来，我们将存在或不存在ACT或NIC处理（条件培养基）的暴露于SiO₂的RAW264.7细胞的上清液应用于成纤维细胞，并测量成纤维细胞的增殖和迁移。来自NIC处理的RAW264.7细胞的上清液显著抑制SiO₂诱导的细胞迁移，而来自ACT处理的RAW264.7细胞的上清液增加细胞迁移。此外，在存在或不存在ACT或NIC（条件培养基）的情况下生长的正常生理RAW264.7细胞的上清液对成纤维细胞迁移发挥相同的作用。来自NIC处理的RAW264.7细胞的上清液引起对SiO₂诱导的成纤维细胞活化的显著抑制，而来自ACT处理的RAW264.7细胞的上清液引起成纤维细胞活化增加。

    我们对临床矽肺患者的检查证实了我们的发现，与来自健康供体的患者相比，来自矽肺患者的BALF的巨噬细胞中HECTD1水平显著增加。此外，我们观察到HECTD1与矽肺患者的肺组织中的巨噬细胞标记物F4/80之间的共定位。基于这些结果，来自矽肺患者的巨噬细胞显示HECTD1水平增加并且经历细胞凋亡和活化，从而促进矽肺病的发展。

    circRNA是广泛表达的非编码RNA非常稳定，但是circRNA的功能知之甚少。在这里，我们的研究阐明了SiO₂诱导的巨噬细胞活化与circHECTD1/HECTD1通路之间的联系，从而为HECTD1在开发治疗矽肺的新治疗策略中的潜在用途提供了新的见解。

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