circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma

HNF4a调节circRNA_104075刺激YAP依赖性肿瘤发生，可作为肝细胞癌的诊断标志物

    期刊：Cell Death Dis；影响因子：5.638

    发表单位：同济大学附属医院

    之前我们介绍了一篇“转录因子→circRNA→miRNA→肿瘤基因”思路的文章“转录因子 --> circRNA表达 --> 吸附miRNA --> 促进靶基因表达 --> 上皮-间质转化”，本文同样寻找这个思路，转录因子HNF4a与启动子区结合刺激circ_104075表达，circ_104075通过吸附miR-582-3p充当ceRNA以上调YAP表达进而促进肿瘤进展。另外，在研究肿瘤基因3’UTR区域结合miRNA时添加了m6A的影响，思路新颖。

    一些类型的环状RNA（circRNA）在包括肝细胞癌（HCC）在内的人类疾病中异常表达。然而，其机制和诊断作用在很大程度上是未知的。在这里，我们发现circ_104075在HCC组织，细胞系和血清中高表达。机理上，HNF4a与circ_104075启动子的-1409至-1401区域结合以刺激circ_104075的表达。此外，circ_104075通过吸附miR-582-3p充当ceRNA以上调YAP表达。有趣的是，在YAP 3'UTR的353-357区域中鉴定出N6-甲基腺苷（m6A）motif，并且该m6A修饰对于miR-582-3p和YAP 3'UTR之间的相互作用是必需的。

    与线性非编码RNA相比，环状RNA（circRNA）由于其共价闭环结构而高稳定。某些类型的circRNA在HCC患者的组织或血清中异常表达，并且它们表现出促肿瘤发生的作用。由于其在HCC发展中的关键功能及其相对稳定的特征，circRNA显示出作为HCC诊断中的新型生物标志物的潜力。

    从三项关于HCC中的circRNA表达与健康组织的研究中收集微阵列数据。在Huang等人的研究中，鉴定出10个circRNA在HCC中高表达，在Fu等人的研究中鉴定出258个circRNA在HCC中高表达，并且鉴定出456个circRNA在HCC中高表达。在Han等人进行的研究中，发现只有circRNA_104075（circ_104075）在所有三项研究中都高表达（图1a）。在评估十对临床肝组织后，与邻近的正常组织相比，在HCC组织中检测到更高水平的circ_104075（图1b）。与正常肝细胞系（THLE-3和HL-7702）相比，在已建立的HCC细胞系（Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2，Hep1和Huh7）中也观察到circ_104075的更高表达（图1C）。此外，我们检测了circ_104075的水平和几种报道的血清中的lncRNA和microRNA HCC生物标志物。我们发现，与健康个体相比，HCC患者血清中circ_104075的表达更高。这些结果证明circ_104075在HCC组织，细胞系和血清中高表达。

    为了研究circ_104075在HCC中过表达的原因，我们在肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721中过表达或敲低一些国内公认的肝癌促进转录因子（TEAD，CREB，HNF4A，TFCP2，STAT3，C-Myc和FOXO1）。我们观察到只有HNF4a过表达或敲低才能显著刺激或抑制circ_104075的表达。我们还测定了临床肝组织中HNF4a mRNA的水平，发现HCC组织中HNF4a mRNA水平高于邻近正常组织。还鉴定了circ_104075和HNF4a之间的倍数变化的正相关，这表明HNF4a可能促进circ_104075的表达。在circ_104075启动子的-1409至-1401区域中鉴定出HNF4a结合motif。ChIP-qPCR结果表明含有该motif的circ_104075启动子区域（-1482至-1296）可以与HNF4a结合，而其他区域没有表现出这种能力。这些数据证明了HNF4a刺激circ_104075转录。

    接下来，我们研究了HCC中circ_104075刺激哪种通路促进肿瘤。设计了circ_104075表达和siRNA载体以测试表明HCC促进信号传导通路活性的因子的表达，包括AKT，β-连环蛋白，TGF-β，STAT3，HNF4a，YAP，c-Myc和FOXO1。我们观察到仅通过circ_104075过表达刺激YAP的mRNA水平，并且在Bel-7402和SMMC-7721细胞中均被circ_104075敲低抑制。类似地，通过circ_104075过表达促进YAP的蛋白质表达，并通过circ_104075敲低抑制（注意：circRNA过表达寻找靶基因）。circRNA可以作为ceRNA起到吸收microRNA和间接刺激蛋白质表达的作用。我们使用生物信息学工具miRanda预测并筛选了circ_104075的候选microRNA靶标。miR-582-3p，miR-195-3p，miR-3916，miR-548u和miR-4744被预测为与circ_104075组合的5种最可能的微小RNA，具有最高的总分。使用circ_104075特异性探针在过表达Bel-7402和SMMC-7721细胞的circ_104075中进行circRNA探针沉淀，以鉴定实际上与circ_104075结合的miRNA。结果表明miR-582-3p与Bel-7402和SMMC-7721细胞中的circ_104075结合。（注意：预测circRNA结合的miRNA并验证）。荧光素酶报告基因，表明在circ_104075和miR-582-3p预测的结合motif在它们的相互作用中起着至关重要的作用。我们进一步研究了miR-582-3p是否可以直接结合YAP mRNA的3'UTR区域。TargetScan软件用于预测miR-582-3p和YAP mRNA的3'UTR区域中潜在的结合motif，这些motif负责它们的相互作用。荧光素酶实验，表明YAP 3'UTR中的315-321区域可能是由miR-582-3p直接结合的motif。（注意：预测并证明YAP 3'UTR与miRNA结合）。

    m6A修饰在调节mRNA的稳定性中起关键作用。然而，尚不清楚m6A修饰是否会影响microRNA和mRNA之间的相互作用。设计了三对qPCR引物，其分别在YAP的3'UTR中含有三个潜在的miR-582-3p结合motif。使用抗m6A进行RNA-IP-qPCR以检测m6A修饰的水平。荧光素酶实验结果证明YAP 3'UTR的353-357区域的m6A修饰对于YAP 3'UTR和miR-582-3p之间的相互作用是必需的。我们还评估了HCC和邻近正常组织中YAP 3'UTR的235-419区域的m6A修饰水平。数据显示，与HCC组织相比，正常组织中的m6A修饰水平显著更高。这些结果表明YAP 3'UTR中的353-357区域是m6A修饰的，并且这种修饰对于miR-582-3p发挥其YAP抑制功能是至关重要的。

    我们测量了HCC患者，健康个体和其他肝病（包括乙型肝炎，丙型肝炎和肝硬化），其他消化系统癌症（包括结肠癌和胃癌），乳腺癌和肺癌患者的血清circ_104075水平。我们发现HCC患者的circ_104075水平高于健康个体和乙型肝炎，丙型肝炎，肝硬化，肺癌，胃癌，结肠癌和乳腺癌患者;该结果表明circ_104075的升高的表达对HCC是特异性的。表明circ_104075是用于诊断HCC的有希望的血清生物标志物。

    在这里，我们发现circ_104075可以吸收miR-582-3p通过YAP刺激肿瘤发生。YAP是HCC中广泛接受的刺激物，并且发现其在HCC患者的约62％肝组织中被上调。YAP的转基因过表达导致小鼠器官大小和最终HCC的失调。我们发现了一种新的circRNA相关通路，可刺激HCC中的YAP，并提供了YAP促进HCC发生和发展的新证据。

    我们观察到circ_104075激活YAP作为ceRNA以吸收YAP抑制剂miR-582-3p。许多microRNA结合位点存在于各种各样的RNA转录本上;因此，含有miRNA结合位点的所有RNA转录物可以通过竞争共享的miRNA进行通信并相互调节，并充当ceRNA。mRNA，lncRNA和假基因具有ceRNA活性。在HCC中，circRNA可以作为ceRNA起作用以刺激或抑制肿瘤发生。

    本文研究了转录因子HNF4a对circRNA_104075的调控作用，HNF4a更多靶基因预测列表，可按下列方式回复获取。

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