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circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma

文字:[大][中][小] 2018/11/23     浏览次数:    

circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma

HNF4a调节circRNA_104075刺激YAP依赖性肿瘤发生,可作为肝细胞癌的诊断标志物

 

    期刊:Cell Death Dis;影响因子:5.638

    发表单位:同济大学附属医院

 


导 读

 

    之前我们介绍了一篇“转录因子circRNAmiRNA肿瘤基因”思路的文章“转录因子 --> circRNA表达 --> 吸附miRNA --> 促进靶基因表达 --> 上皮-间质转化”,本文同样寻找这个思路,转录因子HNF4a与启动子区结合刺激circ_104075表达,circ_104075通过吸附miR-582-3p充当ceRNA以上调YAP表达进而促进肿瘤进展。另外,在研究肿瘤基因3UTR区域结合miRNA时添加了m6A的影响,思路新颖。

 


摘 要

 

    一些类型的环状RNAcircRNA)在包括肝细胞癌(HCC)在内的人类疾病中异常表达。然而,其机制和诊断作用在很大程度上是未知的。在这里,我们发现circ_104075HCC组织,细胞系和血清中高表达。机理上,HNF4acirc_104075启动子的-1409-1401区域结合以刺激circ_104075的表达。此外,circ_104075通过吸附miR-582-3p充当ceRNA以上调YAP表达。有趣的是,在YAP 3'UTR353-357区域中鉴定出N6-甲基腺苷(m6A)motif,并且该m6A修饰对于miR-582-3pYAP 3'UTR之间的相互作用是必需的。

 


背景介绍

 

    与线性非编码RNA相比,环状RNAcircRNA)由于其共价闭环结构而高稳定。某些类型的circRNAHCC患者的组织或血清中异常表达,并且它们表现出促肿瘤发生的作用。由于其在HCC发展中的关键功能及其相对稳定的特征,circRNA显示出作为HCC诊断中的新型生物标志物的潜力。

 


结 果


1   circ_104075HCC表达

    从三项关于HCC中的circRNA表达与健康组织的研究中收集微阵列数据。在Huang等人的研究中,鉴定出10circRNAHCC表达,在Fu等人的研究中鉴定出258circRNAHCC表达,并且鉴定出456circRNAHCC表达。在Han等人进行的研究中,发现只circRNA_104075circ_104075)在所有三项研究中都表达(图1a)。在评估十对临床肝组织后,与邻近的正常组织相比,在HCC组织中检测到更高水平的circ_104075(图1b)。与正常肝细胞系(THLE-3HL-7702)相比,在已建立的HCC细胞系(Bel-7402Bel-7404SMMC-7721HepG2Hep1Huh7)中也观察到circ_104075的更高表达(图1C)。此外,我们检测了circ_104075的水平和几种报道的血清中的lncRNAmicroRNA HCC生物标志物。我们发现,与健康个体相比,HCC患者血清中circ_104075的表达更高。这些结果证明circ_104075HCC组织,细胞系和血清中表达。



2   circ_104075表达受HCCHNF4a的正调控

    为了研究circ_104075HCC中过表达的原因,我们在肝癌细胞系BEL-7402SMMC-7721中过表达或敲低一些国内公认的肝癌促进转录因子(TEADCREBHNF4ATFCP2STAT3C-MycFOXO1)。我们观察到只有HNF4a过表达或敲低才能显著刺激或抑制circ_104075的表达。我们还测定了临床肝组织中HNF4a mRNA的水平,发现HCC组织中HNF4a mRNA水平高于邻近正常组织。还鉴定了circ_104075HNF4a之间的倍数变化的正相关,这表明HNF4a可能促进circ_104075的表达。circ_104075启动子的-1409-1401区域中鉴定出HNF4a结合motif。ChIP-qPCR结果表明含有该motif的circ_104075启动子区域(-1482-1296)可以与HNF4a结合,而其他区域没有表现出这种能力。这些数据证明了HNF4a刺激circ_104075转录。

 


3   circ_104075通过吸附miR-582-3p刺激YAP表达

    接下来,我们研究了HCCcirc_104075刺激哪种通路促进肿瘤。设计了circ_104075表达和siRNA载体以测试表明HCC促进信号传导通路活性的因子的表达,包括AKTβ-连环蛋白,TGF-βSTAT3HNF4aYAPc-MycFOXO1。我们观察到仅通过circ_104075过表达刺激YAPmRNA水平,并且在Bel-7402SMMC-7721细胞中均被circ_104075敲低抑制。类似地,通过circ_104075过表达促进YAP的蛋白质表达,并通过circ_104075敲低抑制(注意:circRNA过表达寻找靶基因)circRNA可以作为ceRNA起到吸收microRNA和间接刺激蛋白质表达的作用。我们使用生物信息学工具miRanda预测并筛选了circ_104075的候选microRNA靶标。miR-582-3pmiR-195-3pmiR-3916miR-548umiR-4744被预测为与circ_104075组合的5种最可能的微小RNA,具有最高的总分。使用circ_104075特异性探针在过表达Bel-7402SMMC-7721细胞的circ_104075中进行circRNA探针沉淀,以鉴定实际上与circ_104075结合的miRNA。结果表明miR-582-3pBel-7402SMMC-7721细胞中的circ_104075结合。(注意:预测circRNA结合的miRNA并验证)荧光素酶报告基因,表明在circ_104075miR-582-3p预测的结合motif在它们的相互作用中起着至关重要的作用。我们进一步研究了miR-582-3p是否可以直接结合YAP mRNA3'UTR区域。TargetScan软件用于预测miR-582-3pYAP mRNA3'UTR区域中潜在的结合motif,这些motif负责它们的相互作用。荧光素酶实验,表明YAP 3'UTR中的315-321区域可能是由miR-582-3p直接结合的motif。(注意:预测并证明YAP 3'UTRmiRNA结合)

 


4   YAP 3'UTR353~357区域的m6A修饰诱导miR-582-3p的抑制

    m6A修饰在调节mRNA的稳定性中起关键作用。然而,尚不清楚m6A修饰是否会影响microRNAmRNA之间的相互作用。设计了三对qPCR引物,其分别在YAP3'UTR中含有三个潜在的miR-582-3p结合motif。使用抗m6A进行RNA-IP-qPCR以检测m6A修饰的水平。荧光素酶实验结果证明YAP 3'UTR353-357区域的m6A修饰对于YAP 3'UTRmiR-582-3p之间的相互作用是必需的。我们还评估了HCC和邻近正常组织中YAP 3'UTR235-419区域的m6A修饰水平。数据显示,与HCC组织相比,正常组织中的m6A修饰水平显著更高。这些结果表明YAP 3'UTR中的353-357区域是m6A修饰的,并且这种修饰对于miR-582-3p发挥其YAP抑制功能是至关重要的。

 


5   血清circ_104075表明存在肝癌

    我们测量了HCC患者,健康个体和其他肝病(包括乙型肝炎,丙型肝炎和肝硬化),其他消化系统癌症(包括结肠癌和胃癌),乳腺癌和肺癌患者的血清circ_104075水平。我们发现HCC患者的circ_104075水平高于健康个体和乙型肝炎,丙型肝炎,肝硬化,肺癌,胃癌,结肠癌和乳腺癌患者;该结果表明circ_104075的升高的表达对HCC是特异性的。表明circ_104075是用于诊断HCC的有希望的血清生物标志物。



讨 论

    在这里,我们发现circ_104075可以吸收miR-582-3p通过YAP刺激肿瘤发生。YAPHCC中广泛接受的刺激物,并且发现其在HCC患者的约62%肝组织中被上调。YAP的转基因过表达导致小鼠器官大小和最终HCC的失调。我们发现了一种新的circRNA相关通路,可刺激HCC中的YAP,并提供了YAP促进HCC发生和发展的新证据。

    我们观察到circ_104075激活YAP作为ceRNA以吸收YAP抑制剂miR-582-3p。许多microRNA结合位点存在于各种各样的RNA转录本上;因此,含有miRNA结合位点的所有RNA转录物可以通过竞争共享的miRNA进行通信并相互调节,并充当ceRNAmRNAlncRNA和假基因具有ceRNA活性。在HCC中,circRNA可以作为ceRNA起作用以刺激或抑制肿瘤发生。


    本文研究了转录因子HNF4acircRNA_104075的调控作用,HNF4a更多靶基因预测列表,可按下列方式回复获取。


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