Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma

环状RNA cSMARCA5抑制肝细胞癌的生长和转移

    期刊：J. Hepatol.；影响因子： 14.911

    发表单位：第二军医大学

    cSMARCA5通过miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生长和转移

    体内和体外数据表明cSMARCA5抑制HCC细胞的增殖和迁移。从机理上讲，cSMARCA5可以通过海绵吸附miR-17-3p和miR-181b-5p促进TIMP3（一种众所周知的肿瘤抑制因子）的表达。

    肝细胞癌（HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一，过去的三十年中，英国的HCC发病率翻了一番，在美国翻了三倍。很大程度上是因为转移的倾向，5年HCC患者的存活率仍然很低，每年约有600,000名HCC患者死亡。确定转移性HCC的预后生物标志物和治疗靶点至关重要。

    我们首先使用RNA-seq分析HCC组织和癌旁组织的RNA。共检测到13,686个不同的circRNA，排除低丰度后，鉴定了4727个circRNA。其中4214个circRNA已包含在circBase中，其他513个是新的（图1A）。此外，4142个circRNAs由来自2322个基因的蛋白质编码外显子组成（图1B），并且大多数外显子circRNA的长度小于1,000个核苷酸（图1C）。对比HCC文库及ANL文库可知236个差异表达的circRNA中，在HCC中108个被上调，128个被下调（图1D）。通过qRT-PCR检测部分circRNA在40对HCC和ANL组织中的表达（图1E），与RNA-seq结果一致。

    选择cSMARCA5用于进一步研究，因为它是差异表达的丰富的circRNA之一，其在HCC中显著下调，但其pre-mRNA、mRNA、蛋白水平上调，表明cSMARCA5在HCC中的较低表达不仅仅是剪接的副产物并且暗示了功能性，已证明其在肿瘤细胞转移性传播的早期具有至关重要的意义。通过逆转录实验证明cSMARCA5没有poly-A尾。此外，cSMARCA5对RNaseR具有抗性。半衰期测量证明cSMARCA5比mSMARCA5更稳定，qRT-PCR和荧光原位杂交（FISH）显示cSMARCA5的主要细胞质分布。

    构建cSMARCA5野生型载体及两端片段截断载体，发现只有野生型载体能高表达cSMARCA5，这说明了I14RC和I16RC对cSMARCA5的产生是不可或缺的。对RNA结合蛋白相关基因进行敲除发现，在敲除DHX9后，cSMARCA5明显上调，而pSMARCA5和mSMARCA5没有显示出显著变化，并且这种效应可以通过过表达野生型DHX9转基因而不是'解旋酶死亡'突变体来挽救，表明调节依赖于其解旋酶活性。使用针对DHX9的抗体进行了RNA免疫沉淀（RIP），并观察到I14RC和I16RC的显著富集。此外，DHX9在HCC中明显上调并在HCC组织中与cSMARCA5的表达负相关。

    Kaplan-Meier的存活曲线显示，肝癌切除术后肝癌患者cSMARCA5表达较低的HCC患者总体具有较低的生存率（OS）和无复发生存率（RFS）。多变量分析表明cSMARCA5表达水平，连同AFP，肿瘤大小，病理性卫星，封装，是OS的独立危险因素，cSMARCA5表达水平，与AFP，肿瘤大小，微血管入侵，封装，是RFS的独立危险因素。

    CCK-8测定，划痕伤口愈合和transwell迁移测定显示过表达cSMARCA5后HCC细胞的生长和迁移显著延迟。敲低cSMARCA5促进了HCC细胞的生长和迁移。在体内，裸鼠皮下注射cSMARCA5过表达细胞显示肿瘤的生长被显著抑制。将皮下肿瘤组织原位植入的肝内转移模型发现显著更少的肝内转移。随后，通过尾静脉注射建立肺转移模型使用体内成像系统进一步证实cSMARCA5的过表达可显著抑制肺转移。

    用SMMC-7721和Huh7细胞中抗AGO2的抗体进行RNA免疫沉淀（RIP），cSMARCA5被AGO2抗体显著富集。这一结果表明cSMARCA5可能作为一个AGO2和miRNA的结合平台。使用miRanda miRNA靶标预测工具找到65个可能与cSMARCA5结合的潜在miRNA。其中29个在人HCC或ANL中表达，结合circRIP，使用特异性针对cSMARCA5的探针，发现cSMARCA5，miR-17-3p和miR-181b-5p的特异性富集。使用这两种miRNA进行荧光素酶测定、生物素偶联的miR-17-3p或miR-181b-5p模拟物的下拉实验证实了他们之间的相互作用。此外，双FISH（荧光原位杂交）测定表明cSMARCA5和这两种miRNA的共定位。

    分别过表达miR-17-3p和miR-181b-5p模拟物，TIMP3都下调。cSMARCA5过表达时TIMP3是显著上调，cSMARCA5敲低时最明显地下调。我们观察到外源miR-17-3p或（和）miR-181b-5p可显著抑制TIMP3的表达，并且在cSMARCA5过表达后抑制被抑制。CCK-8测定、Transwell迁移测定显示miR-17-3p或（和）miR-181b-5p可以促进HCC细胞的生长和转移，并且这种作用可以被过表达的cSMARCA5阻断。此外，TIMP3的mRNA水平下调并且与HCC组织中cSMARCA5的表达正相关。总之，结果表明cSMARCA5至少部分地通过miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生长和转移。

    我们的研究表明，circRNA可能抑制HCC的生长和转移，并作为肝切除术后肝细胞癌患者的预后生物标志物。此外，在HCC中初步证实了DHX9-cSMARCA5-miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路的调节作用。我们的研究结果为进一步的肝癌中circRNA的功能，诊断和治疗研究奠定了基础。

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