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Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis
FBXW7环状RNA在抑制胶质瘤肿瘤发生中的新作用
期刊：J. Natl. Cancer Inst.；影响因子：11.238
发表单位：中山大学附属第一医院
导 读
circRNA翻译蛋白质，并抑制肿瘤进展。
摘 要
circ-FBXW7在正常人脑中大量表达。circ-FBXW7编码一种新的21kDa蛋白质：FBXW7-185aa。FBXW7-185aa在癌细胞中的上调抑制了增殖和细胞周期加速，而FBXW7-185aa的敲低在体外和体内促进了恶性表型。FBXW7-185aa通过拮抗USP28诱导的c-Myc稳定化来降低c-Myc的半衰期。
背景介绍
环状RNA（circRNA）是在真核基因组中广泛存在的RNA转录物。近期的证据表明，circRNA在组织发育，基因调控和癌发生中起重要作用。然而，尽管近期报道了几种circRNA的翻译，但是circRNA是否编码功能性蛋白仍然是难以捉摸的。
结 果
1 人胶质母细胞瘤及相邻正常组织中不同的circRNA表达模式
我们对来自10对临床胶质母细胞瘤组织及其癌旁组织混样成1个肿瘤组织、1个癌旁组织，进行了circRNA-seq分析，然后进行find_circ鉴定circRNAs，并与circBase数据库比对。我们接下来使用RefSeq数据库注释这些已识别的候选者。鉴定的circRNA的染色体分布在癌组和正常组之间没有显著差异，而癌组中circRNA的总表达被下调。我们专注于在癌组和正常组之间具有大的差异表达的候选物，并将它们与circRNADb匹配。在这些特异性候选物中，由FBXW7基因的外显子3和外显子4的环化形成的novel_circ_022705引起了我们的注意。
2 将circ-FBXW7鉴定为环状RNA
设计收敛和发散引物，其特异性扩增FBXW7的经典或反向拼接形式，验证了FBXW7基因的外显子3和4形成内源性circRNA。接下来，使用Sanger测序确认circ-FBXW7连接。我们发现反向拼接形成620 nt circ-FBXW7而不是Circbase中报道的1227 nt circ-FBXW7，很可能是由于内含子序列剪切。合成的circRNA表达载体成功过表达circ-FBXW7，由剪接受体（SA）和供体（SD）的侧翼重复序列诱导，对于缺乏下游侧翼序列的对照载体未观察到。利用FISH分析进行circ-FBXW7细胞定位，不同细胞组分的q-PCR分析证实circ-FBXW7主要位于细胞质中（注意：此处发现该circ与circbase的不一致，测序得到的circ长度与circbase不一致时，要好好实验确认，circbase的结果是软件导出的，未经实验验证的）。
3 Circ-FBXW7编码能力评估
在circ-FBXW7中存在潜在的跨越连接ORF，5'-帽独立翻译需要内部核糖体进入位点（IRES）。使用双荧光素酶载体系统验证了circ-FBXW7中潜在的IRES活性，表明circ-FBXW7 IRES可以诱导5'-帽独立翻译。随后建立一组载体以确认circ-FBXW7可在人体细胞中翻译，并在阳性对照中添加FLAG标签。FLAG标签抗体仅在circ-FBXW7-FLAG-和FBXW7-FLAG-转染的细胞中检测到约22kDa蛋白质，表明circ-FBXW7-FLAG载体被翻译。然后使用液相色谱串联质谱仪进一步表明该新蛋白（FBXW7-185aa）由circ-FBXW7编码。
4 FBXW7-185aa对胶质瘤细胞的作用及其分子机制
建立稳定的circ-FBXW7过表达U251和U373细胞，其中IRES序列突变但载体可以与circ-FBXW7形成相似的circRNA的IRES突变载体用作阴性对照。与其对照细胞相比，稳定过表达U251和U373细胞的Circ-FBXW7和FBXW7-FLAG表现出大量G1期阻滞，并且存活率降低。特异性shRNA敲低circ-FBXW7降低了FBXW7-185aa的表达，增加了细胞周期加速和细胞活力。表明FBXW7-185aa，但不是circ-FBXW7，可诱导细胞周期停滞并减少胶质瘤细胞的增殖。
我们发现c-Myc的表达在circ-FBXW7-和FBXW7-185aa-过表达细胞中也降低，半衰期测试表明FBXW7-185aa可以使c-Myc去稳定化。体内和体外泛素化测定显示FBXW7-185aa过表达拮抗USP28诱导的c-Myc的去泛素化和增加的c-Myc遍在蛋白化。然而在Hs683和SW1783细胞中，如果FBXW7α被敲低，FBXW7-185aa的过表达不能降低c-Myc，表明FBXW7-185aa通过FBXW7α调节c-Myc。表明FBXW7-185aa与USP28竞争性地相互作用并“释放”FBXW7α以降解c-Myc（注意：关联重要转录因子Myc)。
5 circ-FBXW7和FBXW-185aa的临床意义
在38对组织中，胶质母细胞瘤组织中circ-FBXW7表达与配对的相邻非癌组织相比较低。同时，与低circ-FBXW7表达的患者相比，具有更高表达的胶质母细胞瘤患者（38名患者中的8名，21.1％）具有增加的总存活时间。与对照细胞相比，稳定过表达U251和U373细胞的circ-FBXW7表现出低得多的致肿瘤性。此外，稳定过表达U251和U373细胞植入小鼠的circ-FBXW7比对照小鼠寿命更长（每组5只小鼠）。
讨 论
该研究仅限于培养细胞和异种移植动物模型。circ-FBXW7和FBXW7-185aa的临床意义也可能需要通过更多实验得到解决。此外，虽然肿瘤抑制作用是确定的，但FBXW7-185aa的临床应用还有很长的路要走。
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