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Diverse Long RNAs Are Differentially Sorted into Extracellular Vesicles Secreted by Colorectal Cancer Cells

文字:[大][中][小] 2018/11/23     浏览次数:    

Diverse Long RNAs Are Differentially Sorted into Extracellular Vesicles Secreted by Colorectal Cancer Cells

结直肠癌外泌体中差异表达的long RNAs

 

    期刊:Cell Reports;影响因子:8.032

    发表单位:哈佛医学院神经病学系

 


导 读

 

    本研究对外泌体中的long RNAs使用RNAseq技术检测表达的RNAs,发现有大量的mRNAlncRNA存在与外泌体中。

 


摘 要

 

    外泌体编码和长非编码RNAlncRNAs; > 200nt)的调节和功能作用在很大程度上是未知的。我们以前发现KRAS突变型结直肠癌(CRC)细胞释放外泌体含有不同蛋白质,microRNA和环状RNA。在这里,我们全面识别CRC细胞EV中分泌的多种长链RNA,并描述他们的特征。

 


材料方法

 

    RNAseq样品选择:含有单个WTG13D KRAS等位基因的亲本细胞DLD-1,重组产生的子细胞系含有单个WTDKs-8),单个G13DDKO-1)细胞。每种细胞分别测原细胞及其上清液中的外泌体。每个三重复。共计18个样品。

    RNAseq实验方法:采用去核糖体RNA建库的方式,富集mRNA, lncRNA等长非编码RNA。(也能富集到circRNA,但本文没有展现数据。)

 


结 果


1   细胞中long RNAEV的比较

    对于所有细胞谱,大约70%的配对reads比对到人类基因组中的单一位置,而在EV中,比对百分比低得多(30-50%)。

 


2   差异RNA输出和KRAS状态

    为了进一步分析细胞和EV之间以及WT和突变体KRAS之间的总体长RNA谱是否不同,我们进行了主成分分析(PCA)。PCA显示,当比较亲本细胞RNA谱和它们分泌的EV RNA时,长RNA谱库明显不同(图2A)。如果单独比较细胞RNA表达模式,在各种培养条件下,大概KRAS状态分离(图S2)。外泌体的不同分组混在一起,分离度较差(注意:我们可以看出细胞是相对稳定,彼此大约可以分开。但外泌体不能分开。说明外泌体较复杂,或许需要更多的样品寻找规律)。


 


3   EVncRNAmRNA的差异富集

    在EV中上调的绝大多数长链RNA在所有三种同基因系(12,814RNA)中共享,表明这些RNA的输出机制主要与KRAS无关。这与我们在先前的miRNA谱中观察到的相反,其中大多数RNADKO-1 EV中被上调。

进行独特上调的exRNA的基因本体论(GO)分析以更好地理解EV RNA信号传导的可能影响。有趣的是,约5,000EV RNA不能唯一地分配到特定的GO类别,这表明大量未注释的RNA被特异性地输出到EV中,并且它们的潜在功能尚未被了解。

 


4   mRNA转入EV

    我们检测到了许多源自EV中的mRNAreads。其中一些在肿瘤发生中具有已知的作用,包括Rab13NET1NEDD4。一些mRNA具有全长mRNA reads分布模式,Rab13BMI1的数据支持成熟的完整mRNA的存在。相反,来自其他mRNA(例如,Rab3b)的EV读数不仅显示来自外显子的读数,而且还显示内含子的丰富读数,表明未加工的,未剪接的mRNA转录物或更可能的RNA片段的输出。

由于RNA-seq不能区分全长或片段化序列,我们使用qRT-PCRRT-PCR来验证EVmRNA的水平,并测试EV中是否存在全长转录。虽然技术困难可能会抑制长RNA的逆转录,但我们无法扩增大多数1 kb的大多数mRNA,这表明大多数较长的mRNA可能不会作为EV中的完整mRNA存在,与以前的工作一致。有趣的是,我们无法通过RT-PCR检测全长BMI1转录物,而我们能够检测全长Rab13b-肌动蛋白mRNA。与细胞谱相比,任何EV制剂中肌动蛋白或mRNA水平都不富集。

 


5   lncRNAEV

    对于EV差异lncRNA的富集,我们发现许多富含EVlncRNA与其匹配的同源细胞(包括反义RNA)和衍生自假基因的转录物相比较。大多数高度上调的lncRNA要么未经注释,要么之前未进行过研究,这表明这些RNA通过导入EV可能发挥作用。

 


6   mRNA的细胞外转移

    我们再次使用transwell测定支持Rab13-HA mRNA的细胞外转移。Rab13-HA蛋白在受体细胞中也是可检测的,但同样,只有当DKO-1细胞作为供体细胞时。在这种情况下,标记的蛋白质可能已经转移到EVRab13-HA mRNA可能已被转移并随后在受体细胞中翻译。

 


7   lncRNA的细胞外转移

    为了测试lncRNA的转移,我们开发了CRISPR-Display系统,与通过EV转移一致,我们能够检测EV颗粒中的全长修饰的gRNA。表明外泌体可以转移lncRNA

 


讨 论

    我们的数据支持这样的假设:长链RNA输出到EV中是一个选择性过程,来自EVRNA表达谱不仅仅反映细胞RNA丰度。由于最初的研究表明mRNA和蛋白质的水平转移,几乎所有已知类型的RNA都在细胞外液中被检测到。然而,证明功能性长编码和非编码RNA转移的确定性研究是有限的。我们显示长的编码和非编码RNA可以在供体和受体细胞之间转移,并且KRAS状态在调节这种转移中起作用。

 

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