Diverse Long RNAs Are Differentially Sorted into Extracellular Vesicles Secreted by Colorectal Cancer Cells

结直肠癌外泌体中差异表达的long RNAs

    期刊：Cell Reports；影响因子：8.032

    发表单位：哈佛医学院神经病学系

    本研究对外泌体中的long RNAs使用RNAseq技术检测表达的RNAs，发现有大量的mRNA，lncRNA存在与外泌体中。

    外泌体编码和长非编码RNA（lncRNAs; > 200nt）的调节和功能作用在很大程度上是未知的。我们以前发现KRAS突变型结直肠癌（CRC）细胞释放外泌体含有不同蛋白质，microRNA和环状RNA。在这里，我们全面识别CRC细胞EV中分泌的多种长链RNA，并描述他们的特征。

    RNAseq样品选择：含有单个WT和G13D KRAS等位基因的亲本细胞DLD-1，重组产生的子细胞系含有单个WT（DKs-8），单个G13D（DKO-1）细胞。每种细胞分别测原细胞及其上清液中的外泌体。每个三重复。共计18个样品。

    RNAseq实验方法：采用去核糖体RNA建库的方式，富集mRNA, lncRNA等长非编码RNA。（也能富集到circRNA，但本文没有展现数据。）

    对于所有细胞谱，大约70％的配对reads比对到人类基因组中的单一位置，而在EV中，比对百分比低得多（30％-50％）。

    为了进一步分析细胞和EV之间以及WT和突变体KRAS之间的总体长RNA谱是否不同，我们进行了主成分分析（PCA）。PCA显示，当比较亲本细胞RNA谱和它们分泌的EV RNA时，长RNA谱库明显不同（图2A）。如果单独比较细胞RNA表达模式，在各种培养条件下，大概按KRAS状态分离（图S2）。外泌体的不同分组混在一起，分离度较差。（注意：我们可以看出细胞是相对稳定，彼此大约可以分开。但外泌体不能分开。说明外泌体较复杂，或许需要更多的样品寻找规律）。

    在EV中上调的绝大多数长链RNA在所有三种同基因系（12,814种RNA）中共享，表明这些RNA的输出机制主要与KRAS无关。这与我们在先前的miRNA谱中观察到的相反，其中大多数RNA在DKO-1 EV中被上调。

进行独特上调的exRNA的基因本体论（GO）分析以更好地理解EV RNA信号传导的可能影响。有趣的是，约5,000个EV RNA不能唯一地分配到特定的GO类别，这表明大量未注释的RNA被特异性地输出到EV中，并且它们的潜在功能尚未被了解。

    我们检测到了许多源自EV中的mRNA的reads。其中一些在肿瘤发生中具有已知的作用，包括Rab13，NET1和NEDD4。一些mRNA具有全长mRNA reads分布模式，Rab13和BMI1的数据支持成熟的完整mRNA的存在。相反，来自其他mRNA（例如，Rab3b）的EV读数不仅显示来自外显子的读数，而且还显示内含子的丰富读数，表明未加工的，未剪接的mRNA转录物或更可能的RNA片段的输出。

由于RNA-seq不能区分全长或片段化序列，我们使用qRT-PCR和RT-PCR来验证EV中mRNA的水平，并测试EV中是否存在全长转录。虽然技术困难可能会抑制长RNA的逆转录，但我们无法扩增大多数1 kb的大多数mRNA，这表明大多数较长的mRNA可能不会作为EV中的完整mRNA存在，与以前的工作一致。有趣的是，我们无法通过RT-PCR检测全长BMI1转录物，而我们能够检测全长Rab13和b-肌动蛋白mRNA。与细胞谱相比，任何EV制剂中肌动蛋白或mRNA水平都不富集。

    对于EV差异lncRNA的富集，我们发现许多富含EV的lncRNA与其匹配的同源细胞（包括反义RNA）和衍生自假基因的转录物相比较。大多数高度上调的lncRNA要么未经注释，要么之前未进行过研究，这表明这些RNA通过导入EV可能发挥作用。

    我们再次使用transwell测定支持Rab13-HA mRNA的细胞外转移。Rab13-HA蛋白在受体细胞中也是可检测的，但同样，只有当DKO-1细胞作为供体细胞时。在这种情况下，标记的蛋白质可能已经转移到EV或Rab13-HA mRNA可能已被转移并随后在受体细胞中翻译。

    为了测试lncRNA的转移，我们开发了CRISPR-Display系统，与通过EV转移一致，我们能够检测EV颗粒中的全长修饰的gRNA。表明外泌体可以转移lncRNA。

    我们的数据支持这样的假设：长链RNA输出到EV中是一个选择性过程，来自EV的RNA表达谱不仅仅反映细胞RNA丰度。由于最初的研究表明mRNA和蛋白质的水平转移，几乎所有已知类型的RNA都在细胞外液中被检测到。然而，证明功能性长编码和非编码RNA转移的确定性研究是有限的。我们显示长的编码和非编码RNA可以在供体和受体细胞之间转移，并且KRAS状态在调节这种转移中起作用。

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