Cervical squamous cell carcinoma-secreted exosomal miR-221-3p promotes lymphangiogenesis and lymphatic metastasis by targeting VASH1

宫颈鳞状细胞癌分泌的外泌体miR-221-3p通过靶向VASH1促进淋巴管生成和淋巴转移

    期刊：Oncogene ；影响因子： 6.854

    发表单位：广州医科大学附属第一医院

    外泌体miR-221-3p通过靶向VASH1促进淋巴管生成和淋巴转移

    我们发现miR-221-3p与CSCC的肿瘤周围淋巴管生成和淋巴结（LN）转移密切相关。miR-221-3p特征性地富集并通过CSCC分泌的外泌体转移到人淋巴管内皮细胞（HLECs）中以促进体外HLECs迁移和管形成。

    宫颈鳞状细胞癌（CSCC）是最常见的恶性肿瘤之一，其在全世界女性恶性肿瘤中的发病率约为15％。超过20％的早期CSCC患者患有术后复发，主要是由于手术前发生淋巴转移。越来越多的证据表明，肿瘤周围的淋巴管是肿瘤细胞从其原发部位向区域淋巴结（LN）传播的高速公路。然而，肿瘤驱动的肿瘤周围淋巴管生成的分子机制尚未明确定义。

    使用原位杂交（ISH）在107个石蜡包埋的人CSCC连续切片中检查miR-221-3p水平。与LN阴性组相比，在LN阳性组的原发肿瘤部位检测到显著高水平的miR-221-3p。相应地，较高的miR-221-3p水平与CSCC标本连续切片中肿瘤周围淋巴管密度（PLVD）的增加强烈相关。更重要的是，除肿瘤细胞外，一些肿瘤周围淋巴管中也存在高miR-221-3p水平。表明高水平的miR-221-3p表达可促进淋巴管生成并促进CSCC中的淋巴转移（注意：这个miRNA在TCGA宫颈癌中有的，去查一下，可以知道是否上调）。

    从Siha和Ect1细胞的上清液中纯化外泌体。通过透射电子显微镜证实了典型的杯形形态和30-100nm的尺寸范围。蛋白质印迹检测包括CD63和CD81的外泌体阳性标记。荧光标记后用于共聚焦显微镜评估。受体HLEC细胞质内的绿色荧光标点信号表明外泌体内化。在用PKH67标记的外泌体孵育的MLEC中也观察到相同的现象。用CSCC分泌的外泌体处理后，在受体HLEC和MLEC中观察到miR-221-3p细胞水平的增加。

    将过表达miR-221-3p或阴性对照（NC）的慢病毒载体转染到Ect1（低miR-221-3p）中，并将慢病毒载体沉默miR-221-3p或NC应用于Siha（高miR-221-3p）。定量qRT-PCR和增殖，迁移和管形成测定显示，具有高miR-221-3p的外泌体显著促进HLEC和MLEC迁移和管形成，表明外泌体miR-221-3p在体外促进淋巴管生成。有趣的是，HLECs和MLECs的增殖似乎不受miR-221-3p高或低的外泌体的影响。

    使用popliteal LN 转移模型在体内评估外泌体miR-221-3p对CSCC淋巴管生成和淋巴转移的影响。ISH和IHC分析表明在一些肿瘤周围淋巴管中存在显著更高水平的miR-221-3p，与从Ect1/miR-NC和Siha/anti-221-3p分泌的miR-221-3p低的那些相比较，肿瘤细胞处理的外泌体具有从Ect1/miR-221-3p和Siha/抗NC分泌的高水平miR-221-3p。在具有高外泌体miR-221-3p的组中，与具有低外泌体miR-221-3p的组相比，发现转移阳性popliteal LN的比例更高。总之，这些结果表明CSCC分泌的外泌体miR-221-3p可以促进体内淋巴管生成和LN转移。

    使用多种算法（miRWalk,PicTar和TargetScan）预测135个靶基因受miR-221-3p调节，血管抑制素-1（VASH1）作为由Gene Ontology Consortium证实的淋巴管生成的负调节剂起作用并且被选择用于进一步研究。将VASH1（野生型）的3'-UTR中预测的miR-221-3p结合位点或突变序列（突变型）克隆到荧光素酶报告质粒中，评估他们对HLEC中miR-221-3p的反应得出VASH1是miR-221-3p的直接靶标。

    进一步的体外研究证实，VASH1的重新表达可以消除Ect1/miR-221-3p和Siha/抗NC外泌体介导的HLECs迁移和管形成的促进，而沉默VASH1可能引起Ect1/miR-NC和Siha/抗221-3p外泌体在HLEC中诱导迁移和管形成的能力。总之，这些结果表明外泌体miR-221-3p通过抑制HLEC中的VASH1表达诱导淋巴管生成。

    在I-II期CSCC患者（n=20）或无LN转移的循环中分离并表征外泌体发现形态，大小范围和相关蛋白质与来自条件培养基的那些一致。LN阳性患者中分离的循环外泌体miR-221-3p表达在循环中显著高于LN阴性患者。HLECs发芽试验结果显示，来自LN阳性患者而非LN阴性患者的循环外泌体增加了HLEC的萌芽淋巴管生成，其可被miR-221-3p抑制剂消除。

    研究发现循环外泌体miR-221-3p水平与肿瘤miR-221-3p水平和淋巴管生成呈正相关，但与VASH1表达呈负相关。人CSCC组织中的免疫荧光和ISH也证明肿瘤中的高miR-221-3p水平伴随着LYVE1阳性淋巴管中VASH1表达降低和PLVD增强，即CSCC分泌的外泌体miR-221-3p通过下调HLEC中的VASH1表达促进淋巴管生成，然后促进淋巴转移。

    总之，我们的数据提供了证据表明高水平的循环外泌体miR-221-3p在CSCC中与LN转移相关并且与PLVD正相关。将CSCC分泌的外泌体miR-221-3p水平转移到HLEC中可以通过调节VASH1信号传导促进淋巴管生成，然后促进淋巴转移。新发现的细胞间miR-221-3p-VASH1轴显示了CSCC进展的关键分子机制，为CSCC患者LN转移提供了新的诊断和治疗靶点。

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