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Cervical squamous cell carcinoma-secreted exosomal miR-221-3p promotes lymphangiogenesis and lymphatic metastasis by targeting VASH1

文字:[大][中][小] 2018/11/23     浏览次数:    

Cervical squamous cell carcinoma-secreted exosomal miR-221-3p promotes lymphangiogenesis and lymphatic metastasis by targeting VASH1

宫颈鳞状细胞癌分泌的外泌体miR-221-3p通过靶向VASH1促进淋巴管生成和淋巴转移

    期刊:Oncogene ;影响因子: 6.854

    发表单位:广州医科大学附属第一医院

 


导 读

 

  

    外泌体miR-221-3p通过靶向VASH1促进淋巴管生成和淋巴转移

 


摘 要

 

 

    我们发现miR-221-3pCSCC的肿瘤周围淋巴管生成和淋巴结(LN)转移密切相关。miR-221-3p特征性地富集并通过CSCC分泌的外泌体转移到人淋巴管内皮细胞(HLECs)中以促进体外HLECs迁移和管形成。



背景介绍

 

    宫颈鳞状细胞癌(CSCC)是最常见的恶性肿瘤之一,其在全世界女性恶性肿瘤中的发病率约为15%。超过20%的早期CSCC患者患有术后复发,主要是由于手术前发生淋巴转移。越来越多的证据表明,肿瘤周围的淋巴管是肿瘤细胞从其原发部位向区域淋巴结(LN)传播的高速公路。然而,肿瘤驱动的肿瘤周围淋巴管生成的分子机制尚未明确定义。

 


结 果


1   miR-221-3p的上调与CSCCLN转移呈正相关

    使用原位杂交(ISH)在107个石蜡包埋的人CSCC连续切片中检查miR-221-3p水平。LN阴性组相比,在LN阳性组的原发肿瘤部位检测到显著高水平的miR-221-3p。相应地,较高的miR-221-3p水平与CSCC标本连续切片中肿瘤周围淋巴管密度(PLVD)的增加强烈相关。更重要的是,除肿瘤细胞外,一些肿瘤周围淋巴管中也存在高miR-221-3p水平。表明高水平的miR-221-3p表达可促进淋巴管生成并促进CSCC中的淋巴转移注意:这个miRNA在TCGA宫颈癌中有的,去查一下,可以知道是否上调)

 


2   miR-221-3p可富含CSCC分泌的外泌体并转移至LEC

    从SihaEct1细胞的上清液中纯化外泌体。通过透射电子显微镜证实了典型的杯形形态和30-100nm的尺寸范围。蛋白质印迹检测包括CD63CD81的外泌体阳性标记。荧光标记后用于共聚焦显微镜评估。受体HLEC细胞质内的绿色荧光标点信号表明外泌体内化。在用PKH67标记的外泌体孵育的MLEC中也观察到相同的现象。CSCC分泌的外泌体处理后,在受体HLECMLEC中观察到miR-221-3p细胞水平的增加

 


3   CSCC分泌的外泌体miR-221-3p在体外促进淋巴管生成

    将过表达miR-221-3p或阴性对照(NC)的慢病毒载体转染到Ect1(低miR-221-3p)中,并将慢病毒载体沉默miR-221-3pNC应用于Siha(高miR-221-3p)。定量qRT-PCR增殖,迁移和管形成测定显示,具有高miR-221-3p的外泌体显著促进HLECMLEC迁移和管形成表明外泌体miR-221-3p在体外促进淋巴管生成。有趣的是,HLECsMLECs的增殖似乎不受miR-221-3p高或低的外泌体的影响。

 


4   CSCC分泌的外泌体miR-221-3p在体内促进淋巴管生成和淋巴转移

    使用popliteal LN 转移模型在体内评估外泌体miR-221-3pCSCC淋巴管生成和淋巴转移的影响。ISHIHC分析表明在一些肿瘤周围淋巴管中存在显著更高水平的miR-221-3p,与从Ect1/miR-NCSiha/anti-221-3p分泌的miR-221-3p低的那些相比较,肿瘤细胞处理的外泌体具有从Ect1/miR-221-3pSiha/NC分泌的高水平miR-221-3p。在具有高外泌体miR-221-3p的组中,与具有低外泌体miR-221-3p的组相比,发现转移阳性popliteal LN的比例更高。总之,这些结果表明CSCC分泌的外泌体miR-221-3p可以促进体内淋巴管生成和LN转移

 


5   CSCC分泌的外泌体miR-221-3p靶向淋巴VASH1以诱导淋巴管生成

    使用多种算法(miRWalk,PicTarTargetScan)预测135个靶基因受miR-221-3p调节血管抑制素-1VASH1)作为由Gene Ontology Consortium证实的淋巴管生成的负调节剂起作用并且被选择用于进一步研究。将VASH1(野生型)的3'-UTR中预测的miR-221-3p结合位点或突变序列(突变型)克隆到荧光素酶报告质粒中,评估他们对HLECmiR-221-3p的反应得出VASH1miR-221-3p的直接靶标

    进一步的体外研究证实,VASH1的重新表达可以消除Ect1/miR-221-3pSiha/NC外泌体介导的HLECs迁移和管形成的促进,而沉默VASH1可能引起Ect1/miR-NCSiha/221-3p外泌体在HLEC中诱导迁移和管形成的能力。总之,这些结果表明外泌体miR-221-3p通过抑制HLEC中的VASH1表达诱导淋巴管生成

 


6   CSCC分泌的外泌体miR-221-3pVASH1表达和淋巴转移相关

    在I-IICSCC患者(n=20)或无LN转移的循环中分离并表征外泌体发现形态,大小范围和相关蛋白质与来自条件培养基的那些一致。LN阳性患者中分离的循环外泌体miR-221-3p表达在循环中显著高于LN阴性患者HLECs发芽试验结果显示,来自LN阳性患者而非LN阴性患者的循环外泌体增加了HLEC的萌芽淋巴管生成,其可被miR-221-3p抑制剂消除。

    研究发现循环外泌体miR-221-3p水平与肿瘤miR-221-3p水平和淋巴管生成呈正相关但与VASH1表达呈负相关。人CSCC组织中的免疫荧光和ISH也证明肿瘤中的高miR-221-3p水平伴随着LYVE1阳性淋巴管中VASH1表达降低和PLVD增强CSCC分泌的外泌体miR-221-3p通过下调HLEC中的VASH1表达促进淋巴管生成,然后促进淋巴转移


讨 论

    总之,我们的数据提供了证据表明高水平的循环外泌体miR-221-3pCSCC中与LN转移相关并且与PLVD正相关。将CSCC分泌的外泌体miR-221-3p水平转移到HLEC中可以通过调节VASH1信号传导促进淋巴管生成,然后促进淋巴转移。新发现的细胞间miR-221-3p-VASH1轴显示了CSCC进展的关键分子机制,为CSCC患者LN转移提供了新的诊断和治疗靶点。

    

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