Circular RNA circAGO2 drives cancer progression through facilitating HuR-repressed functions of AGO2-miRNA complexes

circAGO2通过HuR阻止AGO2-miRNA复合物的形成来促进癌症进展

    期刊：Cell Death Differ.；影响因子：8

    发表单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院

    本文介绍了一种circRNA可以结合HuR蛋白，促进HuR在靶基因的3'-UTR富集，阻止AGO2结合，从而调控靶基因的稳定性，进而起到促进癌症进展的作用。

    AGO2是miRNA诱导的沉默复合物的核心成分，在肿瘤发生和侵袭性中起着重要的作用。我们鉴定了一种由circAGO2产生的circRNA作为AGO2-miRNA复合物和癌症进展的新型调节因子。机制研究揭示circAGO2机理上与人抗原R（HuR）蛋白相互作用，以促进其对靶基因的3'非翻译区的激活和富集，导致AGO2结合的减少和AGO2/miRNA介导的与癌症进展相关的基因沉默的抑制。

    最近的研究表明，AGO2在许多类型的癌症中异常表达，例如胃癌，结肠直肠癌，前列腺癌和神经母细胞瘤，并且调节癌细胞的增殖，迁移和侵袭，表明AGO2在人类癌症的发展和进展中具有重要的作用。然而，调节AGO2在肿瘤发生和侵袭性中的功能的机制仍然是难以捉摸的。

    环状RNA数据库circBase中AGO2基因来源的circRNA有六种，在胃癌AGS细胞中可检测到两种。一种circRNA（hsa_circ_0135889）称为circAGO2，在胃癌，结肠癌，前列腺癌组织中高于癌旁组织。通过使用不同引物和Sanger测序的RT-PCR验证了由AGO2的部分第一内含子组成的391-nt circAGO2的环化。亚细胞分级和RNA荧光原位杂交（FISH）测定表明癌细胞中circAGO2的细胞质和核富集和定位。此外，在Northern印迹分析表明癌细胞系中检测到circAGO2高表达。这些结果表明circAGO2在癌组织和细胞系中上调。

    建立靶向circAGO2连接的表达载体和短发夹RNA（shRNA）并稳定转染到癌细胞中，分别导致其过表达或敲除。circAGO2的异位表达或沉默分别增加和降低胃癌细胞系MKN-45和AGS的不依赖于锚定的生长和侵袭能力。此外，癌细胞形成的皮下异种移植物的生长，体积和重量分别通过稳定过表达或敲低circAGO2而显著增加和减少。用尾静脉注射circAGO2过表达或敲低细胞也证明circAGO2表达与肿瘤迁移相关。这些数据表明circ-AGO2在肿瘤发生和侵袭性中发挥致癌作用。

    进行了生物素标记的线性或环状RNA下拉，然后对AGS细胞中的RNA相关蛋白复合物进行蛋白质组学分析。质谱分析显示存在767种与circAGO2作用的蛋白，并与RBPDB数据库和AGO2结合蛋白建立的RBP重叠，发现四个潜在的circAGO2相互作用的蛋白。进一步RNA下拉和蛋白质印迹分析表明circAGO2只与HuR相互作用。电泳迁移率改变分析（EMSA），GST融合标签Pull-down， FISH共定位分析也证明了circAGO2与HuR相互作用。

    通过RNA-seq在用circAGO2稳定转染的MKN-45细胞中观察到624个差异表达的基因，257个上调和367个下调。使用HuR CLIP-seq数据集的重叠分析揭示了在其3'-UTR内具有富含AU的元件的132个靶基因，其中以下基因EIF4EBP3、HNF4A、MAP4K1、NOTCH4、SLC2A4和SLC44A4与癌症进展相关，RIP测定表明HuR或AGO2与上述基因的3'-UTR的内源结合。敲除HuR降低了HuR和AGO2对靶基因3'-UTR的内源富集，并且消除了MKR-45细胞中circAGO2异位表达诱导的HuR结合增加和AGO2富集减少。敲除HuR或转染miRNA模拟物抑制靶基因3'-UTR报告基因的活性，其通过circAGO2的异位表达或miRNA结合位点的突变而消除。总之，这些发现表明circAGO2促进癌细胞中AGO2-miRNA复合物的HuR抑制功能。

    HuR的敲低或异位表达导致mRNA稳定性和靶基因EIF4EBP3，HNF4A，MAP4K1，NOTCH4，SLC2A4和SLC44A4的表达显著降低或增加，其分别通过MKN-45和AGS细胞中circAGO2的过表达或沉默而被拯救。在软琼脂，划痕和基质胶侵袭测定中，用sh-HuR＃2或HuR稳定转染的癌细胞分别呈现生长，迁移和侵袭性的降低或增加。这些数据表明，circAGO2通过激活癌细胞中的HuR而具有致癌性质。

    慢病毒介导的sh-circAGO2＃1处理的异种移植物中，circAGO2、EIF4EBP3、HNF4A、MAP4K1、NOTCH4、SLC2A4和SLC44A4的肿瘤内表达显著下调。在癌症转移的治疗实验中，施用慢病毒介导的sh-circAGO2＃1降低了肺转移集落并增加了裸鼠的存活概率。这些结果表明慢病毒介导的circAGO2敲低抑制了体内肿瘤发生和侵袭性。

    我们设计了一种细胞穿透肽，命名为长度为13个氨基酸的HuR抑制肽（HIP-13），来阻止circAGO2-HuR的相互作用。用荧光素异氰酸酯（FITC）标记的HIP-13处理AGS细胞导致肽在细胞质内明显聚集。生物素标记的肽下拉测定揭示了HIP-13与内源circAGO2的结合。施用HIP-13抑制AGS细胞的活力，生长和侵袭。尾静脉施用HIP-13显著减少肺转移集落并增加用尾静脉注射AGS细胞处理的无胸腺裸鼠的存活概率。

    在81个原发病例中，与未转移的患者相比，转移的胃癌组织中观察到更高水平的circAGO2或HuR。含222例组织微阵列的免疫组织化学染色显示胃癌中HuR高表达，与病理分级，局部浸润，淋巴结转移或晚期肿瘤淋巴结转移（TNM）阶段有关。此外，来自Kaplan-Meier绘图仪（http://kmplot.com/analysis）的良好定义的胃癌病例的Kaplan-Meier生存图显示HuR、EIF4EBP3、HNF4A、MAP4K1、NOTCH4、SLC2A4或SLC44A4的高表达与患者的较低总体（OS）和第一进展（FP）存活概率相关。这些结果表明，circAGO2和HuR高表达，并且与胃癌的不良预后相关。

    总之，我们首次证明了circAGO2在癌组织中上调，并与患者的预后不良有关。CircAGO2通过促进其从细胞核向细胞质的转运而与HuR相互作用并激活HuR，由此HuR抑制AGO2/miRNA介导的基因沉默，从而促进肿瘤发生和侵袭性。本研究扩展了我们对circRNA调控AGO2/miRNA功能的认识，并提出circAGO2和HuR可能是人类癌症的潜在治疗靶点。

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