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Circular RNA circAGO2 drives cancer progression through facilitating HuR-repressed functions of AGO2-miRNA complexes

文字:[大][中][小] 2018/11/8     浏览次数:    

Circular RNA circAGO2 drives cancer progression through facilitating HuR-repressed functions of AGO2-miRNA complexes

circAGO2通过HuR阻止AGO2-miRNA复合物的形成促进癌症进展

 

    期刊:Cell Death Differ.;影响因子:8

    发表单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院

 


导 读

 

    本文介绍了一种circRNA可以结合HuR蛋白,促进HuR在靶基因的3'-UTR富集,阻止AGO2结合,从而调控靶基因的稳定性,进而起到促进癌症进展的作用。

 


摘 要

 

    AGO2miRNA诱导的沉默复合物的核心成分,在肿瘤发生和侵袭性中起着重要的作用。我们鉴定了一种由circAGO2产生的circRNA作为AGO2-miRNA复合物和癌症进展的新型调节因子。机制研究揭示circAGO2机理上与人抗原RHuR)蛋白相互作用,以促进其对靶基因的3'非翻译区的激活和富集,导致AGO2结合的减少和AGO2/miRNA介导的与癌症进展相关的基因沉默的抑制。

 


背景介绍

 

    最近的研究表明,AGO2在许多类型的癌症中异常表达,例如胃癌,结肠直肠癌,前列腺癌和神经母细胞瘤,并且调节癌细胞的增殖,迁移和侵袭,表明AGO2在人类癌症的发展和进展中具有重要的作用。然而,调节AGO2在肿瘤发生和侵袭性中的功能的机制仍然是难以捉摸的。

 


结 果


1   CircAGO2在人类癌症组织和细胞系中上调

    环状RNA数据库circBaseAGO2基因来源circRNA有六种,在胃癌AGS细胞中可检测两种。一种circRNAhsa_circ_0135889)称为circAGO2,在胃癌,结肠癌,前列腺癌组织中高于癌旁组织。通过使用不同引物和Sanger测序的RT-PCR验证了由AGO2的部分第一内含子组成的391-nt circAGO2的环化。亚细胞分级和RNA荧光原位杂交(FISH)测定表明癌细胞中circAGO2的细胞质和核富集和定位。此外,在Northern印迹分析表明癌细胞系中检测到circAGO2高表达。这些结果表明circAGO2在癌组织和细胞系中上调。

 


2   CircAGO2促进癌细胞的生长,侵袭和转移

    建立靶向circAGO2连接的表达载体和短发夹RNAshRNA)并稳定转染到癌细胞中,分别导致其过表达或敲除。circAGO2的异位表达或沉默分别增加和降低胃癌细胞系MKN-45AGS的不依赖于锚定的生长和侵袭能力。此外,癌细胞形成的皮下异种移植物的生长,体积和重量分别通过稳定过表达或敲低circAGO2显著增加和减少。用尾静脉注射circAGO2过表达或敲低细胞也证明circAGO2表达与肿瘤迁移相关。这些数据表明circ-AGO2在肿瘤发生和侵袭性中发挥致癌作用。

 


3   CircAGO2与癌细胞中的HuR蛋白相互作用并将其激活

    进行了生物素标记的线性或环状RNA下拉,然后对AGS细胞中的RNA相关蛋白复合物进行蛋白质组学分析。质谱分析显示存在767circAGO2作用的蛋白,并与RBPDB数据库和AGO2结合蛋白建立的RBP重叠,发现四个潜在的circAGO2相互作用的蛋白。进一步RNA下拉和蛋白质印迹分析表明circAGO2HuR相互作用。电泳迁移率改变分析(EMSA),GST融合标签Pull-down, FISH共定位分析也证明了circAGO2HuR相互作用。

 


4    CircAGO2促进HuR抑制AGO2-miRNA复合物的形成

    RNA-seq在用circAGO2稳定转染的MKN-45细胞中观察到624个差异表达的基因257个上调和367个下调。使用HuR CLIP-seq数据集的重叠分析揭示了在其3'-UTR内具有富含AU的元件的132个靶基因,其中以下基因EIF4EBP3HNF4AMAP4K1NOTCH4SLC2A4SLC44A4与癌症进展相关RIP测定表明HuRAGO2上述基因3'-UTR的内源结合。敲除HuR降低了HuRAGO2对靶基因3'-UTR的内源富集,并且消除了MKR-45细胞中circAGO2异位表达诱导的HuR结合增加和AGO2富集减少。敲除HuR或转染miRNA模拟物抑制靶基因3'-UTR报告基因的活性,其通过circAGO2的异位表达或miRNA结合位点的突变而消除。总之,这些发现表明circAGO2促进癌细胞中AGO2-miRNA复合物的HuR抑制功能。

 


5    CircAGO2通过激活HuR而具有致癌特性

    HuR的敲低或异位表达导致mRNA稳定性和靶基因EIF4EBP3HNF4AMAP4K1NOTCH4SLC2A4SLC44A4的表达显著降低或增加,其分别通过MKN-45AGS细胞中circAGO2的过表达或沉默而被拯救。在软琼脂,划痕和基质胶侵袭测定中,sh-HuR2HuR稳定转染的癌细胞分别呈现生长,迁移和侵袭性的降低或增加。这些数据表明,circAGO2通过激活癌细胞中的HuR而具有致癌性质。

 


6   慢病毒介导circAGO2敲低体内治疗效果

    慢病毒介导的sh-circAGO21处理的异种移植物中,circAGO2EIF4EBP3HNF4AMAP4K1NOTCH4SLC2A4SLC44A4的肿瘤内表达显著下调。在癌症转移的治疗实验中,施用慢病毒介导的sh-circAGO21降低了肺转移集落并增加了裸鼠的存活概率。这些结果表明慢病毒介导的circAGO2敲低抑制了体内肿瘤发生和侵袭性。

 


7   抑制性肽通过阻断circAGO2-HuR相互作用来抑制癌症进展

    我们设计了一种细胞穿透肽,命名为长度为13个氨基酸的HuR抑制肽(HIP-13),阻止circAGO2-HuR的相互作用。用荧光素异氰酸酯(FITC)标记的HIP-13处理AGS细胞导致肽在细胞质内明显聚集。生物素标记的肽下拉测定揭示了HIP-13与内源circAGO2的结合施用HIP-13抑制AGS细胞的活力,生长和侵袭。尾静脉施用HIP-13显著减少肺转移集落并增加用尾静脉注射AGS细胞处理的无胸腺裸鼠的存活概率。

 


8   CircAGO2HuR高表达,与胃癌预后不良有关

    81个原发病例中,转移的患者相比,转移的胃癌组织中观察到更高水平的circAGO2HuR。含222例组织微阵列的免疫组织化学染色显示胃癌中HuR高表达,与病理分级,局部浸润,淋巴结转移或晚期肿瘤淋巴结转移(TNM)阶段有关。此外,来自Kaplan-Meier绘图仪(http://kmplot.com/analysis)的良好定义的胃癌病例的Kaplan-Meier生存图显示HuREIF4EBP3、HNF4AMAP4K1NOTCH4SLC2A4SLC44A4的高表达与患者的较低总体(OS)和第一进展(FP)存活概率相关。这些结果表明,circAGO2HuR高表达,并且与胃癌的不良预后相关



讨 论

    总之,我们首次证明了circAGO2在癌组织中上调,并与患者的预后不良有关。CircAGO2通过促进其从细胞核向细胞质的转运而与HuR相互作用并激活HuR,由此HuR抑制AGO2/miRNA介导的基因沉默,从而促进肿瘤发生和侵袭性。本研究扩展了我们对circRNA调控AGO2/miRNA功能的认识,并提出circAGO2HuR可能是人类癌症的潜在治疗靶点。


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