PRMT5 circular RNA promotes metastasis of urothelial carcinoma of the bladder through sponging miR-30c to induce epithelial-mesenchymal transition 

PRMT5 circRNA通过海绵状miR-30c促进膀胱尿路上皮癌的转移诱导上皮-间质转化

期刊：Clin. Cancer Res.；影响因子：10.199

发表单位：华南肿瘤学国家重点实验室

    CircPRMT5在促进UCB细胞EMT和/或侵袭性方面发挥关键作用，并且是该疾病的预后生物标志物，表明circPRMT5可以作为UCB患者的可利用治疗靶标

    在本研究中，我们旨在鉴定调节膀胱尿路上皮癌（UCB）细胞EMT的新型circRNA，并探讨其在UCB中的调节机制和临床意义。我们首先使用成对的UCB和正常组织中的circRNA微阵列筛选circRNA表达谱，然后研究在大量UCB患者中上调的circRNA（circPRMT5）的临床意义。最终证实了circPRMT5的上调表达与UCB患者的晚期临床分期和较差的生存率呈正相关，circPRMT5通过海绵miR-30c促进UCB细胞EMT。

    膀胱尿路上皮癌（UCB）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，复发率高。大约70％的患者被诊断为非肌肉浸润性肿瘤（NMIBC），30％患有肌肉浸润性肿瘤（MIBC）。50％的MIBC患者在肺，骨骼和肝脏中发生远处转移，导致预后不良。到目前为止，没有有效的治疗方法可用于肿瘤转移的UCB患者。因此，更好地理解驱动肿瘤发生和/或进展的分子机制UCB对于开发更有效的抗癌治疗是至关重要的。

    我们使用CircRNA微阵列比较了三对UCB组织及癌旁组织样品，火山图证实了circRNA表达的变化。37个环状RNA被上调，而43个环状RNA被下调（图A）。在上调的circRNA中注意到33个外显子，1个内含子和3个基因内circRNA，而在下调的circRNA中注意到35个外显子，5个内含子，1个基因内和2个反义circRNA。前15个上调和下调的circRNA通过层次聚类显示（图B）。

    circRNA_101320被评估为UCB中最高度上调的circRNA。通过浏览人类参考基因组，我们发现circRNA_101320来自PRMT5，位于染色体14q11.2上，因此我们将其命名为circPRMT5。通过RT-qPCR，我们验证了与119个癌旁组织中相比，circPRMT5的表达在UCB中经常过表达（图C）。进一步的统计分析评估了UCB中circPRMT5的高表达与晚期T和N状态呈正相关，并且显示出较差的无病生存（DFS）（图D）。通过RT-PCR，Sanger测序（图E）和Northern印迹（图F）在T24细胞中进一步分析circPRMT5。用RNA酶R核酸外切酶消化的抗性证实该RNA种类是圆形的。通过mRNA分级（图G）和荧光原位杂交（FISH）进一步检查（图H）显示大多数circPRMT5优先定位于细胞质中。

    首先构建shRNA，用其消耗circPRMT5导致其mRNA水平明显降低。我们进一步检查了PRMT5的5'邻近基因，发现circPRMT5的敲低或circPRMT5的过表达对邻近基因没有影响。用短发夹RNA消耗可显著抑制UCB细胞迁移和侵袭能力。UCB 5637细胞中circPRMT5的异位过表达显著增加细胞迁移和侵袭能力。随后，在BALB/c裸鼠尾静脉静脉注射T24细胞稳定表达并用circPRMT5 shRNA对照，评估其在体内肿瘤转移中的作用，结果显示注射circPRMT5 shRNA细胞的小鼠肺部转移结节少于注射对照细胞的小鼠。然而，与对照组相比，注射具有稳定过表达circPRMT5的细胞的小鼠显著增加肺中的肿瘤结节。

    Western blot显示，UCB细胞中circPRMT5的敲低，上皮标志物E-钙粘蛋白的表达增加，而间充质标志物Vimentin和N-钙粘蛋白的表达均降低。相反，circPRMT5的过表达导致E-钙粘蛋白的表达下调，并且上调UCB细胞中的Vimentin和N-钙粘蛋白的表达。进一步的免疫荧光（IF）染色证实上述结果。这些发现表明circPRMT5促进了UCB细胞EMT。此外，我们的结果显示宿主基因PRMT5的表达水平没有因UCPR细胞中circPRMT5的敲低或过表达而改变，表明circPRTM5在促进EMT中的病理作用不依赖于PRMT5。

    我们首先评估circPRMT5区域AGO2的占用情况。通过对稳定表达Flag-AGO2和Flag-GFP的T24细胞中AGO2的RNA免疫沉淀，我们观察到通过RT-qPCR分析特异性地富集从Flag-AGO2细胞下拉的内源circPRMT5，表明circPRMT5被掺入进入RNA诱导的沉默复合物（RISC复合物）。为了鉴定与circPRTM5结合的miRNA，我们用miRNA模拟物库进行荧光素酶筛选。结果表明circPRMT5可以作为miR-30c，miR-335，miR-188，miR-377和miR-597这五种miRNA的海绵起作用。接下来使用生物素标记的circPRMT5探针进行RNA体内沉淀（RIP）找到与其相互作用的真正的miRNA：miR-30c。同时，RNA-FISH测定法将内源和外源表达的circPRMT5与miR-30c共定位，从而进一步得到证实。

    我们使用miR-30c的抑制剂来检查是否可以通过miR-30c抑制剂拯救circPRMT5耗尽的作用。结果显示，miR-30c抑制剂可以在功能上恢复circPRMT5沉默抑制的UCB细胞迁移和侵袭能力。另一方面，miR-30c模拟物可以基本上防止circPRMT5过表达增强的UCB细胞迁移和侵袭。我们的体内小鼠模型研究也支持这样的观点。我们假设circPRMT5可能通过充当miR-30c海绵来增强miR-30c下游靶标的表达水平。使用miRanda分析，我们发现miR-30c可以直接靶向SNAIL1的3'非翻译区（3'UTR），这是一种促进细胞EMT的关键转录因子。进一步证明circPRMT5通过降低海绵活性对miR-30c的抑制作用来促进UCB细胞EMT和侵袭性。

    我们发现circPRMT5的水平与SYSUCC群组的UCB中的miR-30c表达呈负相关。此外，在SYSUCC的同一队列中，高表达的circPRMT5与上调的SNAIL1和下调的E-钙粘蛋白显著相关，这意味着circPRMT5与UCB患者的EMT进展密切相关。我们评估了miR-30c的低表达与UCB患者中较差的存活显著相关，此外，miR-30c的表达水平在没有转移的患者中显著上调，这与miR-30c在UCB细胞EMT中的抑制功能一致。此外，miR-30c的表达水平与UCB患者中SNAIL1的表达呈负相关，同时，高表达的SNAIL1与低表达的E-钙粘蛋白显著相关。这些数据一起表明，UCB中的miR-30c途径对于癌细胞EMT进展是必需的。

    我们收集了来自71名UCB患者和36名正常人的大量血清，以及来自18名UCB患者和14名正常人的尿液。在通过连续离心分离血清和尿外来体后，我们通过几种方法表征这些囊泡，例如电子显微镜和蛋白质印迹。外泌体标志物CD63，TSG101，HSP70和ALIX的高存在证实了分离的UCB分泌的外泌体在血清和尿液中的纯度。RT-qPCR分析显示，circPRMT5富含源自UCB患者的血清和尿外泌体，UCB中高表达的circPRMT5可能分泌到肿瘤微环境中，血清和尿外泌体中高表达的circPRMT5与淋巴结转移和晚期肿瘤进展呈正相关。

    在本研究中，我们首次证明circPRMT5是UCB组织中经常上调的重要circRNA，并且circPRMT5的高表达与UCB患者转移和/或较差的存活率正相关。其次，从机理研究中，我们发现circPRMT5的上调充当了miR-30c的海绵，并通过竞争miR-30c调节SNAIL1/E-钙粘蛋白途径以促进UCB细胞EMT。第三，我们发现过表达的circPRMT5由外泌体分泌到UCB患者的血清和尿液中，预测肿瘤淋巴结转移。鉴于SNAIL1/E-钙粘蛋白信号传导在癌细胞EMT进展中的重要性，我们的研究结果首次表明circPRMT5作为人类UCB新治疗靶点的重要性。

其他相关文献解读

文献解读：lncRNA Atrolnc-1促进慢性肾病小鼠的肌肉萎缩(IF:12.511)

文献解读：活性依赖性LoNA通过协调rRNA转录和甲基化来调节翻译（12.353）

文献解读：MIR100宿主基因编码的lncRNA通过调节HuR与其靶mRNA之间的相互作用来调节细胞周期（11.561）

文献解读：基于CRISPRi的基因组规模鉴定人细胞中功能性lncRNA（IF:41.058）

文献解读：S期富集的lncRNA的泛癌分析鉴定致癌驱动因子和生物标志物（IF:12.353）

文献解读：H19诱导腹主动脉瘤的发展和进展（IF18.88）

文献解读：在人类早期发育过程lncRNA XACT在控制X染色体活性上与XIST竞争（IF:23.290）

文献解读：lncRNA lncKdm2b通过启动Zfp292表达来持续维持ILC3细胞(IF:21)