Activity dependent LoNA regulates translation by coordinating rRNA transcription and methylation

活性依赖性LoNA通过协调rRNA转录和甲基化来调节翻译

期刊：NATURE COMMUNICATIONS；影响因子：12.353

发表单位：中国科学技术大学

    长核仁特异性lncRNA LoNA在调节rRNA转录和转录后修饰中起关键作用，其还可以调节突触可塑性，抑制其表达可改善WT小鼠的学习和记忆，并挽救APP/PS1小鼠的学习和记忆受损。

    核糖体对于精确控制蛋白质合成的能力是必不可少的。然而，如何协调转化机制以满足转化需求仍然是难以捉摸的。在这里，我们鉴定核仁特异性lncRNA（LoNA），其5'部分结合并隔离核仁蛋白以抑制rRNA转录，其snoRNA如3'末端募集并减少纤维蛋白活性以减少rRNA甲基化。LoNA的活性依赖性降低导致rRNA和核糖体水平升高，多核糖体比例增加，mRNA多核苷酸负载和蛋白质翻译。此外，特别促进核糖体向突触的转运，导致AMPA/NMDA受体水平增加，突触可塑性增强，长期增强和巩固记忆。引人注目的是，海马LoNA缺乏不仅增强了WT小鼠的长期记忆，还恢复了APP/PS1转基因小鼠的记忆功能受损。总之，这些发现揭示了LoNA在调节核糖体生物发生中的多方面作用，以满足长期记忆的转化需求。

    已知神经元活性通过多种机制调节蛋白质合成，包括关键转录因子的磷酸化，rRNA和mRNA的加工和成熟，以及核仁数的控制。核仁数量在神经元的整个发育过程中不同，表明通过调节核仁组装来适应神经元对蛋白质合成的需求的变化。rRNA是核糖体的RNA组分，对于所有生物体中的蛋白质合成是必需的。神经元的刺激增加rRNA产生，并且rRNA合成减少和核仁破坏是与衰老和神经退行性疾病相关的细胞应激的主要迹象。这些观察结果表明核仁和核糖体RNA生物发生的重要作用涉及学习和记忆，以及神经疾病。

    我们使用Morris水迷宫检测了经验诱导的记忆形成小鼠的rRNA水平，与对照组相比，训练小鼠的前rRNA和成熟rRNA水平均显著升高（图a），表明rRNA转录和/或加工在活动依赖性学习和记忆中发挥重要作用。从N2a细胞中分离出核仁RNA，去除rRNA进行高通量RNA测序。9.9％的表达转录物被鉴定为mRNA，其余90.1％被注释为lncRNA（图b，c），表明lncRNA比核仁中的蛋白质编码RNA丰富得多。通过qPCR验证了30种最丰富的lncRNA的表达水平（图d）。为了进一步表征这些lncRNA的功能，我们接下来测量了它们在经受Morris水迷宫训练的小鼠的海马脑中的表达水平（图e），以及活化的培养神经元（图f）。我们的目的是鉴定那些在受过训练的小鼠中水平显著降低，并且在活化的培养神经元中显示出时间依赖性降低的lncRNA。使用这些标准，我们鉴定了一个lncRNA，GM17382，它是高度的在海马脑中表达，在神经元中特别丰富。

    通过免疫染色和FISH成像显示GM17382与polR1E共定位，表明它在核仁中特异性富集。因此，我们将其重命名为LoNA。用各种聚合酶抑制剂治疗表明LoNA转录依赖于polII，但不依赖于polI或polIII。用LoNA直接转染N2a细胞以模拟过表达，或用LoNA shRNA或反义寡聚物（ASO）转染以抑制LoNA表达。除qPCR外，通过Northern印迹验证LoNA表达水平。成熟rRNA的Northern印迹分析显示，响应施用LoNA，rRNA的水平显著降低并且当LoNA被抑制时增加，表明LoNA在转录水平上调节rRNA。为了评估LoNA是否影响翻译，我们用LoS或对照质粒转染N2a细胞，用35S-Met/Cys作为从头蛋白质合成的测量，并发现LoNA过表达的N2a细胞显示出显著降低的蛋白质合成率，而LoNA敲低细胞显示出增加的蛋白质合成率，表明LoNA抑制rRNA转录和随后的蛋白质翻译。

    我们进行RNA pull-down实验以鉴定LoNA通过SDS-PAGE和随后的质谱（MS）结合蛋白质。这些测定揭示LoNA与核仁蛋白（NCL）结合。接下来我们产生了针对结合基序中的一个或两个（M1，M2和M1+M2）的LoNA突变体。然后进行生物素化RNA的下拉，发现LoNA主要通过M1结合位点与NCL结合。此外，将含有2kb rDNA启动子区段的荧光素酶报告基因构建体转染到具有LoNA或突变体LoNA的N2a细胞中，荧光素酶活性表明LoNA，而不是LoNA M1突变体，抑制rDNA启动子活性。此外，LoNA过表达减少了UEC上的RNA聚合酶（Pol）I负载，在NCL缺陷细胞中观察到类似的变化。总之，这些观察结果表明，增加的LoNA导致rDNA启动子和编码区中的无活性染色质状态，以及UCE和核心启动子区域上的UBF和PolI负载降低。这些发现还表明，LoNA对染色质状态的影响是通过与NCL结合来减少其活性而不是其表达来实现的。

    MS分析还鉴定了纤维蛋白（FBL）作为推定的LoNA结合蛋白。snoRNA作为小核仁核糖核蛋白颗粒复合物（snoRNP）的一部分具有活性，其中框C和框D形成功能性结构以募集FBL并促进rRNA甲基化。FISH和免疫染色表明LoNA与FBL共定位。RNA免疫沉淀和RNA pull-down进一步证明FBL与LoNA相关。这些观察表明LoNA与snoRNPs复合物相互作用。生物素化的Mut或Del LoNA pull-down测定显示LoNA通过其盒式C/D序列与U3竞争性地结合FBL。用WT，Mut或Del LoNA转染N2a细胞用于过表达，或用shRNA进行敲低。观察到LoNA Mut或Del的施用对rRNA甲基化没有影响，表明rRNA甲基化状态由LoNA通过其盒C/D结构调节，并表明snoRNP功能相应地被调节。具有FBL敲低的N2a细胞中的rRNA甲基化水平（阳性对照）在表型上类似于具有LoNA过表达的N2a细胞。

    我们进行了多核糖体分析测定以监测细胞质翻译，并发现LoNA耗尽的N2a细胞表现出增加的多核糖体比例，表明LoNA降低了翻译效率。我们接下来分别检测了核糖体结合的突触素和突触后密度-95（PSD95）mRNA的水平，观察到来自LoNA敲低的N2a细胞的多重分子中两者的显著增加。接下来，我们敲除或过表达LoNA，包括同时包含M1突变体和盒C/D Del的突变体LoNA，特别是在海马脑中（AAV）使用腺病毒相关的传递技术。从这些小鼠的海马脑中纯化突触体，通过蛋白质印迹测定突触蛋白以及AMPA和NMDA受体的水平。我们的结果显示突触蛋白突触素，snap25，PSD95，AMPA受体GluA2，NMDA受体NR1，NR2A和NR2B的水平在从LoNA敲低小鼠分离的突触体部分中显著升高，在LoNA-过表达的小鼠中降低并且在突变体LoNA-受体小鼠中未改变。这些观察结果表明，LoNA，但不是突变体LoNA，调节突触可塑性。

    在探针试验期间，与对照相比，LoNA敲低小鼠进入目标象限，其中平台已经在训练期间定位，显著更频繁并且花费相当少的时间定位该目标象限。相反，在海马脑中施用LoNA的小鼠表现出空间学习和记忆受损，并且接受突变体LoNA的小鼠表现出与对照相似的表现，表明海马LoNA深入参与学习和记忆。阿尔茨海默病（AD）患者表现出降低的rRNA产生。8个月大的APP/PS1转基因小鼠表现出严重的学习和记忆障碍，并代表AD的动物模型。我们通过AAV传递系统敲除APP/PS1转基因小鼠海马脑中的LoNA，并进行Morris水迷宫和对象-背景辨别行为测试。这些研究表明，与对照APP/PS1小鼠相比，LoNA缺陷的APP/PS1小鼠显示出挽救的学习和记忆缺陷。此外，发现rRNA水平恢复。我们的研究结果表明，LoNA在神经退行性疾病中起着关键作用，可能代表了治疗AD的有希望的治疗靶点。

    我们发现长核仁特异性lncRNA（LoNA），其抑制核仁中rRNA的产生和核糖体生物合成，并最终抑制蛋白质合成。从机制上讲，我们显示LoNA的5'部分含有核仁蛋白（NCL）结合位点并特异性结合NCL。我们证明LoNA通过减弱NCL的转录活性来降低rRNA水平，并且还通过减少FBL活性降低rRNA 2'-O-甲基化，一起导致抑制rRNA产生和改变核糖体异质性。LoNA敲低不仅能够改善WT小鼠的记忆，还能够功能性地挽救AD模型小鼠受损学习和记忆的表型。

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