MIR100 host gene-encoded lncRNAs regulate cell cycle by modulating the interaction between HuR and its target mRNAs

MIR100宿主基因编码的lncRNA通过调节HuR与其靶mRNA之间的相互作用来调节细胞周期

期刊：NUCLEIC ACIDS RESEARCH；影响因子：11.561

发表单位：伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校

    MIR100HG可能作为HuR及其靶mRNA的结合平台，从而调节HuR和靶mRNA相互作用。

    目前，大多数lnc-miRHG的细胞功能尚不清楚。我们证明了核富集的lnc-miRHG在细胞周期进程中的miRNA非依赖性作用。在人体细胞中消耗MIR100HG编码的lncRNA导致异常的细胞周期进程，而不改变MIR100HG内编码的miRNA的水平。MIR100HG与HuR/ELAVL1以及几种HuR靶mRNA相互作用，MIR100HG耗尽的细胞显示HuR与其三种靶标mRNA之间的相互作用减少，表明MIR100HG促进HuR和靶mRNA之间的相互作用。我们的研究发现MIRHG编码的lncRNA在调节RNA结合蛋白活性中发挥了新的作用，从而强调了确定人类基因组中存在的数百种lnc-miRHG功能的重要性。

    LncRNA基于其基因组位置，表达模式或功能进行细分。一些lncRNA在其外显子或内含子序列中含有miRNA，因此被称为miRNA-宿主基因lncRNA（lnc-miRHG）。已经充分研究了由lnc-miRHG加工的miRNA的生物发生和功能。此外，几种lnc-miRHGs在疾病中表现异常，因此可作为重要的诊断或预后标志物。然而，尚不清楚在miRNA加工过程中从pri-miRHG加工的稳定且适当剪接的lnc-miRHG池是否具有任何重要的细胞功能，或仅作为miRNA加工的非功能性副产物。迄今为止很少有研究确定了lnc-miRHG的miRNA非依赖性作用。在本研究中，我们发现多个lnc-miRHG，包括MIR100HG，在细胞周期的特定阶段差异表达。机制研究表明，MIR100HG促进HuR与其靶mRNA的一部分之间的相互作用。

    MIR100HG产生几种MIR100HG lncRNA的同种型，这是由于选择性剪接和差异启动子的使用。为了测试细胞周期中剪接的MIR100HG的相对水平，我们使用外显子-外显子连接引物对在同步的U2OS细胞的RNA样品中进行RT-qPCR分析以扩增外显区域由大多数MIR100HG同种型共有。与我们在pri-miR100HG RNA的情况下观察到的相似，即使是剪接的MIR100HG也显示出升高的水平，特别是在G1期间。靶向最后一个外显子的外显子引物也显示相同的表达模式。发现MIR100HG是主要核和相对稳定的lncRNA，半衰期约为75分钟。通过观察MIR100HG在正常细胞与癌细胞中的表达情况，发现G1期上调的MIR100HG倾向于在癌细胞中表现出升高的表达，并将MIR100HG鉴定为非编码转录本。

    为了确定MIR100HG参与细胞增殖，我们进行了流式细胞仪分析，发现MIR100HG耗尽的U2OS细胞显示G2/M群体水平升高，同时G1群体减少。使用siRNA耗尽MIR100HG的细胞也显示G2/M阻滞而不影响成熟miR-100水平，证实了细胞周期表型的特异性。最后，我们通过在耗尽内源性MIR100HG的细胞中过表达全长剪接的MIR100HG同种型来进行拯救实验。我们观察到MIR100HG cDNA可以部分地拯救G2/M阻滞表型。除G2/M阻滞外，二倍体成纤维细胞（WI-38）中MIR100HG的消耗也导致S期进展缺陷。然后我们在对照和MIR100HG耗尽的U2OS细胞中进行转录组微阵列。我们在MIR100HG耗尽的细胞中鉴定了722个下调基因和另外577个上调基因。分析显示，这些基因其表达水平在MIR100HG耗尽的细胞中发生改变，在控制细胞生长的关键通路中发挥重要作用，包括细胞周期，细胞增殖，细胞死亡和存活，进一步支持在MIR100HG耗尽的细胞中观察到的细胞表型。

    我们使用生物素标记的MIR100HG进行了U2OS核提取物的RNA亲和力下调，进行了质谱分析。然后通过生物素RNA pull-down，免疫印迹测试，证实了MIR100HG和RBP（如HuR，PTB和PUF60）之间的相互作用。HuR可控制多种生物学事件，包括细胞周期，细胞凋亡和癌症进展。因此，我们研究了HuR和MIR100HG之间相互作用的功能意义。我们首先通过细胞周期同步细胞提取物中的HuR核糖核蛋白（RNP）免疫沉淀（RIP）分析，然后RT-qPCR证实了HuR与内源性MIR100HG之间的相互作用。

    我们进行HuR RIP，然后使用来自对照和MIR100HG耗尽的U2OS细胞的RNA进行微阵列。有趣的是，敲除MIR100HG显著降低了HuR与其几种靶mRNA的相关性。此外，通过在对照和MIR100HG耗尽的细胞中进行HuR-RIP，然后进行RT-qPCR，我们证实了HuR与其几种靶mRNA的相关性降低。同时，MIR100HG消耗不改变HuR与几种组成型表达的持家基因mRNA的关联。我们的结果意味着MIR100HG正向调节HuR与其几种靶mRNA的关联。

    我们使用计算预测工具来找到与MIR100HG具有序列互补性的mRNA。根据预测并通过HuR RIP分析，我们将24个mRNA鉴定为HuR相互作用的mRNA。我们的结果表明HuR和MIR100HG可以结合几种共有的靶mRNA。有趣的是，大多数预测mRNA和MIR100HG之间的相互作用是通过MIR100HG最后一个外显子中存在的第一个富含U的重复序列发生的。接下来设计了一种20nt长的21-O-甲氧基乙基反义寡核苷酸（MOE; MOE-100）来测定U重复区域是否对促进lncRNA-mRNA相互作用，结果表明，存在于MIR100HG的3′末端的富含U的序列促进其与HuR靶mRNA的特定成员的相互作用。此外，我们还确定了富含U的序列元素是否也促进了MIR100HG和HuR之间的相互作用。为此，我们使用生物素标记的MIR100HG在细胞提取物中进行RNA亲和力pull-down，所述MIR100HG与生物素标记的对照（SCR）或富含A的MOE（MOE-100）寡核苷酸预孵育，然后进行免疫印迹。HuR仅在SCR-MOE预孵育的提取物中显示出与MIR100HG的强相互作用，而不是在富含A的MOE预孵育的提取物中，表明MIR100HG利用富含U的基序与HuR和HuR靶mRNA相互作用。

    通常认为MIRHG的作用是产生miRNA，并且从MIRHG初级转录物处理的lncRNA不会发挥任何重要作用。然而，近期很少有研究报道了由lnc-miRHGs发挥的miRNA独立作用。这些研究强调了这类lncRNA的功能意义，这在以前被忽略，并表明了解MIRHG编码的lncRNA所起的独立作用的重要性。我们的研究证明了MIR100HG参与细胞周期及其在调节RBP与其靶mRNA的亲和力中的作用，这进一步强调了确定数百种lnc-miRHG在人类基因组中的作用的重要性。

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