PAN-cancer analysis of S-phase enriched lncRNAs identifies oncogenic drivers and biomarkers

S期富集的lncRNA的泛癌分析鉴定致癌驱动因子和生物标志物

期刊：Nature Communications；影响因子：12.353 

发表单位：哥德堡大学 

    该研究采用新生RNA测序的研究结合数据聚类分析、TCGA数据库与严谨的临床数据调查，将肿瘤相关lncRNAs筛选出来，最后提供了一个基于S期相关的lncRNA中具有潜在预后价值的致癌因子或肿瘤标志物的综合性列表。

    本研究提供了基于lncRNA的致癌驱动因子的综合列表，具有潜在的预后价值。在这里，使用新生RNA捕获测序，我们识别1145个时间表达的S期富集的lncRNA。其中，570个lncRNA在TCGA数据集中的至少一种肿瘤类型中显示出显著的差异表达。14个Pan-Cancer数据集的系统临床研究确定了633个独立的预后标志物。在几种癌症模型中沉默顶部差异表达和临床相关的S期富集的lncRNA影响关键的癌细胞标志。SCAT7在多种癌症类型中的机制研究表明，它与hnRNPK/YBX1复合物相互作用，并通过调节FGF/FGFR及其下游PI3K/AKT和MAPK通路影响癌细胞标志。

    尽管研究lncRNA在癌症中的作用的研究数量增加，但我们对癌症发生和发展中lncRNA的理解以及它们与临床预后的相关性尚处于起步阶段。在这项研究中，我们提出了两个基本命题，可以增强当前对lncRNA在癌症发展和进展中的关键作用的理解。首先，我们研究S期特异性lncRNA对细胞周期进展和其他重要癌症相关标志的贡献。其次，我们研究了S期特异性lncRNA在不同癌症中作为独立预后生物标志物的能力。为了实现这些目标，我们在S期进展期间采用新生的RNA-seq并产生基于lncRNA的致癌癌驱动因子的资源，其可用作风险评估中的预后标志物以及癌症治疗中的潜在治疗方案。

    使用胸苷和羟基脲使HeLa细胞在G1/S边界同步，随后，释放G1/S阻断并使细胞在5-乙炔基尿苷（EtU）存在下进行，以便在不同的S期时间点特异性地标记新合成的新生RNA群。我们分别在EtU标记和未标记样品中获得1145个具有四种显著时间表达模式的lncRNA和具有两种显著时间模式的937个lncRNA。我们随机选择动态表达的S期lncRNA，并在EtU标记和未标记样品中跨不同细胞周期阶段（G1，S和G2/M）验证它们的时间表达模式。

我们利用来自癌症基因组图谱（TCGA）的6419种实体瘤和701种正常组织样品的RNA测序数据，这些样品来自16种癌症类型。分析显示，1145个S期特异性lncRNA中的570个在至少一种癌症类型中差异表达，对数倍变化±2和错误发现率（FDR）<1E-004。有趣的是，近73％的差异表达的lncRNA在相应的癌症类型中显示出上调。这些观察结果表明，这些lncRNAs在多种癌症中表现出差异表达，并且可以作为理解它们在癌症发展和进展中的作用的潜在候选者。

    对570个差异表达的S期lncRNA启动子进行CpG甲基化分析，发现35个lncRNA表现出差异甲基化。我们分析了S期lncRNAs的基因-体甲基化，并发现20个与基因表达相关的基因体差异甲基化的转录本。在20个lncRNA中，7个是高甲基化和高度表达的，而13个lncRNA是低甲基化的，在肿瘤中表达较低。对于每种癌症类型，我们根据每种lncRNA的表达水平将患者分为高表达组和低表达组。然后，我们使用Kaplan-Meier（KM）方法评估存活率的差异。我们基于二分法的系统分析鉴定了520个S期lncRNA，其预测存活并且还至少在一种癌症类型中充当潜在的独立生物标志物。多变量模型证明KIRC具有最大数量的基于S期cncRNA的预后生物标志物。值得注意的是，RP11-59D5__B.2是我们临床研究的首选候选者，它作为五种癌症的独立预后指标：BLCA，KIRC，KIRP，STAD和HNSC。总之，大部分S期lncRNA在不同癌症类型中显示出与临床协变量相关的独立预后能力。

    为了进一步的功能验证，我们在TCGA数据集中具有较高频率差异表达的顶级候选者中选择了8个S期lncRNA，其也独立地预测患者在多种癌症中的存活。此后，我们将所选候选者称为S期癌症相关转录物（SCAT）。我们使用HeLa细胞作为模型系统使用小干扰RNA寡核苷酸（siRNA）或锁定核酸（LNA）反义寡核苷酸耗尽SCAT。我们使用比色MTT测定评估发现SCAT耗尽诱导显著影响细胞增殖。使用流式细胞术评估发现SCAT的功能丧失诱导细胞周期扰动，伴随G1期细胞的积累和DNA合成的减少。此外，SCAT的下调诱导细胞凋亡，如胱天蛋白酶3/7活性的显著增加所示。

    我们的临床研究显示CTD-2357A8.3（SCAT1）和LUCAT1（SCAT5）分别作为肺和肾源性癌症的常见独立预后生物标志物。LUAD和LUSC中SCAT1的较高表达与较差的临床结果相关。另外，SCAT1显示同步A549细胞的S期中表达升高。与临床数据一致，A549细胞中SCAT1的下调表现出对细胞增殖的显著抑制，G1期细胞周期停滞，并促进细胞凋亡，表明其在肺癌发生中的作用。类似地，在五种癌症中差异表达的SCAT5在所有三种类型的肾癌（KIRP，KIRC和KICH）中充当独立的预后因子。其较高的表达预测所有三种癌症中的不良临床结果并且与其他SCAT相似，在Caki-2细胞的S期期间诱导SCAT5表达。 Caki-2细胞中SCAT5的消耗导致细胞增殖减少，G1期细胞周期停滞并诱导细胞凋亡。

    使用siRNA或短发夹RNA下调SCAT7的表达，Northern印迹分析中敲低细胞中SCAT7变体的下调表明我们的RNAi敲低实验的特异性。Caki-2,786-O，A549，H2228，HepG2和MCF7细胞中SCAT7的下调影响细胞增殖和细胞周期进展，细胞在G1期优先积累。另外，即使在非癌性HEK293细胞中，SCAT7的敲低也导致增殖减少。此外，SCAT7消除改变了多个细胞系中的S期进展，值得注意的是，与其他细胞系相比，H2228细胞中SCAT7的瞬时敲低诱导了G2/M期细胞的显著积累。我们接下来关注Caki-2,786-O和A549稳定KD细胞系，以阐明SCAT7在细胞凋亡，细胞活力，细胞迁移和侵袭中的功能作用。观察发现SCAT7的过表达分别在Caki-2和A549细胞中使细胞增殖增加2.08倍和1.9倍。然而，由于其对质粒转染的遗传抗性，我们无法在786-O细胞系中过表达SCAT7。总的来说，我们的数据证明了SCAT7在调节多种癌细胞系中一些最重要的癌症标志中的关键作用。

    我们使用了两种成纤维细胞系：BJ和TIG3，用B-RAF转化永生化，使用三种siRNA瞬时下调SCAT7 72小时诱导两种细胞系的衰老。然后我们寻求在诱导早衰时评估SCAT7的转录活性。为此，我们用200nM的4-HT处理BJ-BRAF细胞72小时，并检查一些衰老相关标记的转录激活。有趣的是，过早衰老的开始导致SCAT7表达的显著降低。另一方面，SCJ7在BJ-BRAF成纤维细胞中的过表达增加了它们的增殖以及关键衰老标记物的转录活性。过表达SCAT7的细胞能够绕过他莫昔芬诱导的衰老。我们接下来在SCAT7下调后对HeLa，A549和Caki-2细胞系进行β-半乳糖苷酶染色。SCAT7的下调诱导HeLa和A549细胞的衰老表型，而Caki-2细胞保持不受影响。因此，我们的数据证明了SCAT7在调节细胞衰老中的关键作用，突出了细胞增殖，细胞周期进展和衰老之间的串扰。

    RNA-seq数据的后续功能富集分析显示，SCAT7的消耗影响了主要的信号传导通路和重要的生物过程。例如，FGF/FGFR和下游PI3K/AKT和Ras/MAPK通路受到很大影响，同时细胞增殖，细胞粘附，细胞衰老，细胞迁移和凋亡过程也受到干扰。基于RNA-seq分析和随后跨不同细胞系的验证，我们假设SCAT7通过调节不同的FGF/FGFR成员来调节一些癌症标志。使用两种siRNA分别在HeLa和Caki-2细胞中耗尽FGFR2，并且使用A549细胞中的esiRNA分别耗尽FGFR3和FGFR4。有趣的是，FGFR2消耗对细胞周期，细胞增殖和活力的影响表现出SCL7消耗在HeLa和Caki-2细胞中的作用。此外，当FGFR2沉默时，SCAT7诱导的细胞增殖减弱；表明SCAT7诱导的细胞增殖部分地通过FGF/FGFR2信号传导进行。总之，我们的数据强烈表明SCAT7通过调节FGF/FGFR和下游PI3K/AKT和Ras/MAPK信号传导通路参与调节细胞稳态和细胞周期进程。

    我们首先确定了SCAT7的亚细胞分布，发现它在核质和染色质区室中富集。然后，我们使用生物素化的寡核苷酸在UV交联细胞中进行染色质寡聚亲和沉淀（ChOP）以下拉SCAT7及其相互作用的蛋白质。我们使用RNA免疫沉淀（RIP）测定和ChOP下拉然后Western印迹验证了hnRNPK和YBX1蛋白与SCAT7的相互作用。我们通过ChIP实验评估了hnRNPK和YBX1在FGFR2启动子上的特异性结合，并且这种结合在SCAT7下调后显著降低。类似地，hnRNPK和YBX1占据了FGFR3的启动子区域，并且它们的结合在SCAT7下调后特异性地受到影响。此外，我们观察到SCAT7耗尽细胞中FGFR编码区的RNA聚合酶II占据率降低。总之，这些观察结果表明SCAT7/hnRNPK/YBX1 RNP在不同癌症模型中的FGFR2和/或FGFR3的转录激活中起关键作用。

    我们将A549细胞皮下移植到裸鼠体内。植入后6周，我们应用基于皮下注射两种独立的靶向SCAT7的LNA反义寡核苷酸的治疗方案，每周两次。我们在两次独立实验中进行四次注射后测量肿瘤体积，并且与加扰的LNA对照组相比，在SCAT7 LNA组中观察到40-50％肿瘤生长抑制（TGI）。此外，异种移植物中SCAT7的表达水平与肿瘤体积相关，并且仅在具有有效SCAT7下调的肿瘤中观察到肿瘤生长减少。此外，我们对携带KRAS的致癌突变形式的肺转移性患者来源的异种移植物（PDX）小鼠模型在15天内实施SCAT7 LNA依赖性治疗干预。注射SCAT7 LNA的PDX小鼠模型显示出生长速率以及移植肿瘤的体积（约46％）的显著降低。这些结果共同表明SCAT7是致癌的lncRNA，并且它可以用作治疗不同癌症的可能的治疗靶标。

    总的来说，我们提供了基于lncRNA的致癌驱动因子的综合列表，具有潜在的预后价值。更重要的是，这系统地分析了功能性和临床相关的lncRNA可以作为描述lncRNA与肿瘤发展和进展之间的功能联系的资源。

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