XACT Noncoding RNA Competes with XIST in the Control of X Chromosome Activity during Human Early Development 

在人类早期发育过程lncRNA XACT在控制X染色体活性上与XIST竞争

期刊：CellStemCell；影响因子：23.290 

发表单位：法国巴黎国家科学研究中心 

    lncRNA XACT在人体胚胎中影响XIST的积累，以防止X染色体沉默和功能性无效，并允许在关键发育阶段的剂量补偿的替代策略，而这种机制具有物种特异性。

    性染色体剂量补偿在大多数后生动物中是必不可少的，但发育时间和潜在机制差别很大，甚至在胎盘哺乳动物中也是如此。在这里，我们确定了在早期胚胎发育中调节X染色体活性的人类特异性机制。单细胞RNA测序和成像揭示了早期人类植入前胚胎和幼稚人胚胎干细胞中活性X染色体上的长非编码RNA（lncRNA）XACT和XIST的共激活和积累。在这些情况下，XIST RNA采用了一种不寻常的，高度分散的组织，这可以解释为什么它在此阶段不会触发X染色体失活。转基因小鼠细胞的功能研究表明，XACT影响顺式XIST的积累。因此，我们的研究结果提出了一种机制，涉及XIST和XACT在控制早期人类胚胎X染色体活性中的拮抗活性，并强调快速进化的lncRNA对物种特异性发育机制的贡献。

    在哺乳动物中，必须严格控制X染色体的活性以适应雄性和雌性之间X连锁基因剂量的不平衡。这是通过补偿机制实现的，这种机制可以平衡性别之间和相对于常染色体的X染色体表达。虽然X染色体剂量补偿对于适当的发育是必不可少的，但是基础策略在物种之间变化很大。例如，在小鼠中，X染色体失活（XCI）在合子基因组激活（ZGA）后迅速启动，在胚泡植入之前进行了几次分裂。相反，人类植入前发育在明显缺乏XCI的情况下进行；相反，通过降低女性中两条X染色体的表达来暂时实现剂量补偿。这些差异背后的机制仍然知之甚少。

    我们分析了从人类植入前胚胎产生的四组独立的单细胞RNA测序（RNA-seq）数据，我们根据用于分类胚胎的方法将其分为按发育阶段（数据集1）和发育当天（数据集2）分类两个数据集（图1A）。合子XIST和XACT表达的主要爆发同时发生在四细胞和八细胞阶段之间（图1B）。在这些阶段之前XIST是不可检测的，而对于XACT有一个适度的母体贡献。在雌性和雄性胚胎中，XIST和XACT的表达在发育的早期阶段（从E3到E5的早期）强烈相关，表明在X上分开40 Mb的两个非编码基因可能是共同调节的。（图1C;图S1B）。然而，XIST-XACT相关性在后期胚胎中没有持续存在（从E5到E7，图S1D）。在女性中，XIST和XACT在外胚层（EPI和EPI-TE）和原始内胚层（PE）细胞中共表达。相反，滋养外胚层（TE）细胞显示可变的XACT水平（图1D），同时保持稳定的XIST表达。这种模式表明，一旦启动，XIST和XACT的表达可以独立调节，与XACT被抑制的分化细胞中无活性X染色体的XIST表达持续存在一致。

    雄性和雌性胚泡中XIST和XACT的同时RNA-FISH显示两种转录物通常从X染色体共表达并积聚在细胞核内的大区域中。然而，XIST和XACT RNA差异分布且两个信号几乎不重叠，表明XIST和XACT转录物占据不同的核区域。虽然XIST的表达从早期（B1）到晚期/孵化（B5）胚泡阶段保持恒定，但是根据胚泡细胞数量，具有XACT和XIST共同积累的细胞的比例减少，与胚泡细胞亚群中XACT表达缺失一致。此外，当比较XIST和XACT的相对等位基因表达时，没有发现复发模式，证实一旦激活，XIST和XACT可以独立调节，并表明它们在胚泡中的表达具有一定程度的随机性。

    我们探测了幼稚雌性H9 hESCs中X染色体的染色质模型。对XIST RNA-FISH组合的各种组蛋白标记的免疫荧光（IF）谱的共聚焦分析首先显示在XIST RNA结构域内缺乏H3K27me3和H3K9me3，表明在这种情况下XIST积累不足以引发募集镇压组蛋白标记。对已发表的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据集的分析证实，与表达XIST的致敏细胞中的Xi相比，幼稚hESC中X缺乏H3K27me3和H3K9me3富集。我们接下来通过RNA-FISH研究了幼稚hESC中的XACT表达。在大多数幼稚H9和WIBR3细胞中，XACT在每个X染色体上表达并积累，并且该模式在培养物中稳定维持。加强幼稚hESC和植入前胚胎之间的相似性，定性分析显示，在Xs活跃的条件下胚胎和幼稚hESCs比在表达XIST的引发的hESC中更加分散的XIST RNA-FISH信号，其中XIST包被无活性的X染色体。XIST信号在幼稚与引发的多能细胞中的不同分布可能是其以顺式沉默染色体的有限能力的基础。

    在具有XACT BAC转基因的克隆中特异性地检测到XACT表达，并且在大多数克隆中，XACT在大部分细胞中形成RNA云。通过实时qPCR确定每个这些克隆的插入BAC的拷贝数。当诱导转基因克隆分化时，XIST被适当地上调，尽管程度不同，而XACT表达倾向于在分化时降低，类似于在人体中观察到的。在维持XACT表达的细胞群中，我们观察到XIST包被染色体的选择存在显著偏差，XIST优先从R1和T9克隆中不携带XACT的X上调。然而，在T1克隆中（如在FGD1 BAC整合在X上的克隆中，图S4D），XIST能够在转基因和野生型（WT）X染色体上类似地积累。我们发现XACT占据的核体积与其偏向XIST表达的能力相关。R1和T9克隆中的XACT核体积与初始hESC中的XACS核体积相同，并且显著高于T1克隆中的XACS核体积。T1和T9克隆之间的比较特别相关，因为它们共享XACT的相同插入位点。我们的数据表明XACT在一条X染色体上的强烈积累直接影响XIST在顺式中的表达或定位。

    在这里，通过将多能性的幼稚状态与人类胚胎进行基准测试，我们已经证明人类的前XCI状态的特征在于XIST和XACT在活性X染色体上的同时积累。这种情况与小鼠完全不同，突出了跨物种的表观遗传调控的可塑性以及lncRNA对物种特异性的贡献。

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