Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression

lncRNA lncKdm2b通过启动Zfp292表达来持续维持ILC3细胞

期刊：Nat.Immunol.；影响因子：21.809              

发表单位：中国科学院                                                           

    LncKdm2b表达通过激活转录因子Zfp292促进其增殖，从而持续ILC3的维持。

   在这项研究中，我们观察到一个不同的长非编码RNA，lncKdm2b，在肠组3ILCs（ILC3s）中高水平表达。造血系统中的LncKdm2b缺乏导致ILC3的数量和效应功能的减少。LncKdm2b表达通过激活转录因子Zfp292促进其增殖，从而持续ILC3的维持。在机制上，lncKdm2b将染色质组织者Satb1和核重构因子（NURF）复合物募集到Zfp292启动子上以启动其转录。敲除Zfp292或Bptf也减弱了ILC3的维持，导致易受细菌感染。因此，我们的研究结果表明，lncRNA可能代表ILC发展和功能的另一层调节。

    ILC根据其特征效应细胞因子可分为三组，类似于CD4⁺辅助T细胞亚群的分类：ILC1s、ILC2、ILC3s。ILC3与其他ILC一起来源于最早的祖细胞（α-LP（淋巴祖细胞）细胞，表达整合素α4β7的CXCR+CLPs），其分化成受限制的常见辅助样先天淋巴祖细胞（CHILP）。下游常见ILC前体（ILCP）的特征在于转录因子PLZF的表达，并且可以产生ILC1，ILC2和ILC3亚组。越来越多的证据表明ILC3谱系规范是由命运决定转录因子控制的。例如，RORγt（由Rorc编码）驱动ILC3与其前体ILCP的区别。Rorc缺失导致ILC3完全丧失，但不会导致ILC1或ILC2缺失。此外，芳烃受体在ILC3中以高水平表达，并且是维持ILC3所必需的。ILC3的开发和维护也需要GATA-3。然而，它调节ILC3开发和/或维护的潜在机制仍然是难以捉摸的。

    我们鉴定了胚胎干细胞多能性维持所需的无特征的lncRNA，我们称之为lncKdm2b。LncKdm2b缺陷导致早期胚胎致死。我们观察，lncKdm2b在小鼠的固有层淋巴细胞（LPL）中以高水平组成型表达。然后，我们检测淋巴祖细胞和淋巴细胞中的lncKdm2b表达，发现ILC3群体中的高lncKdm2b表达，并通过RNA荧光原位杂交得到证实。我们通过CRISPR-Cas9技术建立了lncKdm2b^flox/flox小鼠。将lncKdm2b^flox/flox小鼠与Rorc-Cre小鼠杂交以从ILC3s有条件地删除lncKdm2b来生成lncKdm2b^flox/floxRorc-Cre⁺（以下称为lncKdm2b^-/-）小鼠。我们观察到，与lncKdm2b^flox/floxRorc-Cre^-（下文中称为lncKdm2b^+/+）同窝对照小鼠相比，该lncKdm2b缺失导致所有ILC3亚群的数量显著减少。我们通过原位免疫荧光染色验证了这些观察结果，表明lncKdm2b参与ILC3的维持。

    我们观察到的ILC3数量减少可能是由细胞死亡增加和/或细胞群扩大减少引起的。为了评估体内ILC3s的周转率，我们给小鼠施用BrdU3天，然后对来自小肠的组织进行流式细胞术以测量摄取。我们注意到来自lncKdm2b^-/-小鼠的ILC3s比同窝对照小鼠的ILC3s吸收的BrdU少得多。我们接下来分离野生型和lncKdm2b缺陷的ILC3，用CFSE标记它们，并进行体内增殖测定。我们观察到与野生型ILC3相比，lncKdm2b缺陷型ILC3的增殖显著降低。类似地，lncKdm2b缺陷型ILC3中Ki67⁺细胞的频率远低于野生型ILC3中的频率。我们观察到lncKdm2b过表达恢复了lncKdm2b缺乏-受损的增殖。然而，lncKdm2b缺陷小鼠中活性caspase-3⁺ILC3的百分比与野生型小鼠中的百分比相当，这表明lncKdm2b缺陷的ILC3不经历凋亡。总之，这些发现使我们得出结论，lncKdm2b调节ILC3s的增殖，但不调节细胞凋亡。

    我们用来自小鼠LPL裂解物的生物素标记的lncKdm2b进行RNA pull-down测定，以鉴定潜在的lncKdm2b相关蛋白。通过RNApull-down和质谱法鉴定Satb1（基因组组织蛋白）在LPL中与lncKdm2b结合。我们通过RNApull-down和RNA反义纯化进一步验证了lncKdm2b与Satb1的相互作用，然后进行免疫印迹分析，以及通过RNA免疫沉淀测定。Satb1在LPL中以高水平表达，而相关蛋白Satb2不可检测。此外，通过RNA-FISH测定显示lncKdm2b与ILC3细胞核中的Satb1共定位。我们通过结构域作图鉴定了相互作用位点，发现lncKdm2b的特异性片段（nt450-700）是结合Satb1蛋白所必需的。我们通过RNA电泳迁移率变动分析（RNA-EMSA）进一步验证了该lncKdm2b片段与Satb1的结合。这些结果表明lncKdm2b直接结合ILC3中的Satb1蛋白。

   为了进一步确定哪些靶基因受lncKdm2b调节，我们进行了lncKdm2b^+/+ILC3s与lncKdm2b^-/-ILC3s的转录组微阵列分析。在十大下调转录因子中，我们关注的是一种未表征的转录因子Zfp292，其表达减少了五倍。我们通过实时定量PCR（RT-qPCR）和免疫印迹验证了ILC3中Zfp292的下调。值得注意的是，Zfp292优先在ILC3中表达。我们使用生物素标记的lncKdm2b探针通过RNA纯化（CHIRP）分析进行染色质分离。我们发现lncKdm2b沉积在Zfp292启动子的特定区域（nt-1,200至-600）上。此外，我们分离了ILC3（Lin-CD45^loCD90^hi）并进行了染色质免疫沉淀（ChIP）和DNaseI可及性测定。我们发现lncKdm2b^-/-ILC3s中Zfp292启动子的这个区域（nt-1,200到-600）在组蛋白活性标记物Lys4（H3K4me3）的组蛋白H3的三甲基化中富集较少，但对于组蛋白抑制标记物H3K27me3更多。因此，lncKdm2b缺失导致Zfp292启动子上较少的RNA聚合酶II富集，因此对DNaseI消化具有更强的抗性。这些数据表明lncKdm2b激活ILC3中的Zfp292表达。

    我们制备了野生型和lncKdm2b缺陷的LPL裂解物，并将它们应用于固定化的抗Satb1用于色谱法。我们通过SDS-PAGE解析洗脱的级分，然后进行银染和质谱分析。我们鉴定了lncKdm2b^+/+与lncKdm2b^-/-LPL裂解物中的主要差异条带，如Bptf和Snf2l，它们是NURF染色质重塑复合物的一部分。抗-Satb1与lncKdm2b^+/+LPL裂解物中的NURF复合物共沉淀，但在lncKdm2b^-/-LPL裂解物中不存在。lncKdm2b的加入增强了Satur1和Bptf（NURF复合物的核心组分）之间的相互作用，而没有lncKdm2b，Satb1不与Bptf结合。我们用抗Bptf进行了ChIP测定。我们发现Bptf富集在ILC3中的Zfp292启动子上。然而，lncKdm2b或Satb1的缺失消除了这种现象。此外EMSA显示lncKdm2b与Satb1，Bptf和Zfp292启动子区域形成复合物，而用RNaseA和RNaseH处理则消除了该复合物的形成。因此，Bptf缺失基本上抑制Zfp292表达，与Satb1缺陷细胞裂解物中的观察结果一致。总之，这些数据表明lncKdm2b将Satb1和NURF复合物募集到Zfp292启动子上以触发其表达。

    我们通过CRISPR-Cas9方法建立了Zfp292缺陷型小鼠。我们发现与野生型小鼠相比，Zfp292缺失显著降低了ILC3的数量。此外，Zfp292过表达恢复了Zfp292缺失导致的ILC3增殖受损，表明Zfp292是ILC3调节所必需的。值得注意的是，Satb1和Bptf的缺失抑制了ILC3的增殖。在Satb1缺陷型和Bptf缺陷型小鼠的肠中，ILC3数确实减少。与野生型小鼠相比，lncKdm2b^-/-Satb1^-/-Bptf^-/-ILC3中的Zfp292过表达拯救了ILC3增殖。更重要的是，Zfp292^-/-LPL中的lncKdm2b过表达不能挽救ILC3增殖，而Zfp292^+/+LPL中的lncKdm2b过表达确实促进了ILC3增殖。因此，Zfp292^-/-小鼠肯定易受C.rodentium感染。最后，与其同窝野生型对照小鼠相比，lncKdm2b^-/-Zfp292^-/-小鼠表现出大大减少的ILC3数量，以及对细菌感染的更大易感性。总之，Zfp292在调节lncKdm2b介导的ILC3维持中起关键作用。

    在这项研究中，我们证明lncKdm2b在肠ILC3s中以高水平表达。造血系统中的LncKdm2b敲除导致ILC3的数量和效应功能的减少。此外，我们观察到lncKdm2b不影响ILC3的发展，但确实通过促进ILC3的增殖来维持ILC3的维持。从机制上讲，lncKdm2b将Satb1和NURF复合物募集到Zfp292启动子上以启动其转录。Zfp292或Bptf的缺失也消除了ILC3的维持，导致对啮齿类柠檬酸杆菌感染的易感性。

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