A circular RNA promotes tumorigenesis by inducing c-myc nuclear translocation

circRNA通过诱导c-myc核转位促进肿瘤发生

期刊：Cell Death Differ.；影响因子：8.00

发表单位：加拿大多伦多大学

    本文首次发现circRNA通过促进c-Myc入核，促进其发挥功能，为circRNA功能研究提供了新思路。

    我们在此报道了源自血管动蛋白样1（circ-Amotl1）的circRNA的致瘤能力。Circ-Amotl1在患者肿瘤样品和癌细胞系中高度表达。使用circ-Amotl1转染的肿瘤细胞显示显著增强的增殖能力集落形成能力。通过研究发现circ-Amotl1和c-myc之间的相互作用可以触发致瘤性。circ-Amotl1的异位表达增加核c-myc的保留，促进c-myc稳定性和上调c-myc靶标。我们的研究揭示了circRNA在肿瘤发生中的新功能，并且这种ncRNA的亚类可能代表癌症治疗中的潜在靶标。

    全基因组分析揭示了跨物种的circRNA的高水平丰度和进化保守性。circRNA的一种作用方式可能是某些circRNA的miRNA海绵活性，或者一些circRNA可能与RNA结合蛋白结合形成RNA-蛋白复合物并调节其活性等。本研究旨在探讨circ-Amotl1在乳腺癌肿瘤发生中的潜在作用。

    我们检测了许多癌症和癌旁中circRNA的表达，证实了一些circRNA的内源性表达，包括由血管生成抑制素结合蛋白1产生的circRNA（circ-Amotl1，hsa_circ_0004214）。circ-Amotl1由位于11号染色体的Amotl1基因的第三外显子形成。在乳腺癌标本中，circ-Amotl1的表达量明显高于癌旁组织。一些常见的肿瘤细胞系也表现出了circ-Amotl1高表达的特性。当细胞维持过度汇合时，circ-Amot1的水平显著降低，表明circ-Amotl1在细胞增殖中的作用。分别设计针对两种特异性靶向circ-Amotl1的siRNA，表明沉默circ-Amotl1明显抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，阻碍细胞形成集落的能力。随后我们产生了circ-Amotl1过表达构建体，并证实但过表达circ-Amotl1能显著提高细胞增殖能力，抵抗血清饥饿和细胞凋亡。

    分别在MDA-MB-231 或HepG2细胞构建的裸鼠皮下肿瘤模型中，过表达circ-Amotl1明显促进肿瘤增殖，肿瘤组织的体积明显增加。除肿瘤体积的总差异外，我们发现肿瘤块与基质组织之间存在显著的粘附。H＆E染色显示肿瘤细胞和肌肉之间以及肿瘤细胞和骨之间的广泛侵袭。在体外，细胞侵袭测定证明circ-Amotl1转染通过Matrigel增加了MDA-MB-231细胞的侵袭能力。单细胞克隆生成实验也表明过表达circ-Amotl1明显促进肿瘤克隆生成速度，比对照组快了近30倍。过表达circ-Amotl1后细胞倍增时间缩短至15-18h，明显高于对照细胞。通过RNA印迹，我们证实circ-Amotl1在circ-Amot11转染的细胞中高度表达。

    为了研究circ-Amotl1如何触发这种高致瘤性表型，我们进行下拉实验测试了circ-Amtol1与致癌蛋白的潜在相互作用，显示circ-Amotl1被针对c-myc，EGF，c-myb，NF1和AKT的抗体拉下，其中c-myc显示出对circ-Amotl1的最大结合能力，表明c-myc在介导circ-Amotl1功能中的关键作用。我们还检查了c-myc与其他circRNA之间的相互作用。下拉实验显示，针对c-myc的抗体仅沉淀了circ-Amot1，但没有下调其他circRNA。然后反复验证了c-Myc与circ-Amotl1的相互作用情况，特异性靶向circ-Amotl1的环化位点的探针也可以直接钓取到c-Myc蛋白，说明circ-Amotl1与c-Myc 的相互作用是客观稳定的。

    据报道，c-myc可以调节高达15％的基因表达。在circ-Amotl1和载体转染的细胞中分析一些已知c-myc靶标的表达，发现在circ-Amotl1转染细胞中，许多c-myc靶标被上调。此外，我们发现异位circ-Amotl1使用扩增这些启动子的引物增强了c-myc与HIF-1α，Cdc25a，ELK-1和JUN的启动子的结合亲和力。在c-Myc阴性的HO15.19细胞中过表达circ-Amotl1不会促进细胞增殖，沉默circ-Amotl1后显著下调c-myc靶标，验证了c-myc在介导circ-Amotl1功能中的作用。分离亚细胞组分后鉴定结果表明circ-Amotl1和c-Myc均主要定位于细胞核而不是细胞质内。沉默circ-Amotl1产生相反的c-myc分布模式。原位杂交+免疫荧光实验也证明circ-Amotl1与c-Myc共定位在细胞核中。此外高水平的c-myc易位至细胞核，未检测到总c-myc水平降低，表明c-myc与circ-Amotl1共定位，防止降解。

    由于全长c-myc的结构尚未阐明，因此使用I-TASSER构建了3D模型。使用I-TASSER算法计算得到5个c-myc模型以分析潜在的circ-Amotl1结合位点。使用RNABindRPlus，BindN +和Pprint，我们对RNA结合残基进行了c-myc的计算筛选，发现了c-myc与其他RNA结合蛋白共享共有序列，预测了circ-Amotl1与c-myc的结合位点。接下来，我们诱变了c-myc相互作用位点并设计了与结合位点互补的封闭寡核苷酸。当用突变体构建体或阻断寡核苷酸转染细胞时，circ-Amotl1探针不再能够沉淀c-myc，用突变体或阻断寡核苷酸转染的细胞显示出增殖和存活水平降低。随后小鼠模型中验证了所设计的突变分子失去了促进肿瘤生成的作用。

    已知circRNA可以作为调节miRNA活性的海绵起作用，在目前的研究中，我们检测到大致相同水平的Amotl1 mRNA和蛋白质。这表明circ-Amotl1不起结合miRNA的海绵的作用。实际上，为了充当海绵，circRNA必须保留在胞质溶胶中，并且我们观察到circ-Amotl1与c-myc相互作用并易位至细胞核。这些结果表明Amotl1和circ-Amotl1通过不同的机制在促进癌症进展中起作用。这有待进一步调查。

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