Non-coding effects of circular RNA CCDC66 promote colon cancer growth and metastasis

circRNA CCDC66的非编码效应促进结肠癌的生长和转移

期刊：Cancer Res.；影响因子：9.130

发表单位：国立成功大学

    circRNA可用作miRNA海绵促进肿瘤的生长和转移。

    在这里，我们描述了新型circRNA，circCCDC66在结直肠癌（CRC）中的功能作用。来自匹配的正常和肿瘤结肠组织样品的RNA-Seq数据鉴定了癌细胞中特异性升高的多种circRNA，其中几种通过定量RT-PCR验证。CRC细胞系中的功能获得和功能丧失研究表明，circCCDC66控制多种病理过程，包括细胞增殖，迁移，侵袭和不依赖贴壁的生长，其表达在息肉和结肠癌中升高，并且与预后不良有关。深入表征显示circCCDC66通过调节癌基因的子集发挥其功能，并且circCCDC66的敲低分别抑制异种移植和原位小鼠模型中的肿瘤生长和癌症侵袭。总之，这些发现强调了circRNA在癌症进展和转移中的新的致癌功能。

    结直肠癌是第三大常见癌症，2012年新发病例约为140万，并且在美国被列为癌症相关死亡的第二大原因。尽管进行了深入研究和治疗改进，但超过50％的结肠癌患者最终死于这种疾病，这凸显了解开导致结肠癌恶性肿瘤的其他未知机制的必要性。在此，我们的目的是鉴定与结肠直肠癌临床相关的circRNA，并研究这些circRNA在结直肠癌发病机制中的作用。

    我们采取了一个有效的方法，筛选了74个环状RNA。然后选择了源自CCDC66的circRNA，因为没有与其亲本基因相关的已知功能。来自多个细胞系的RT-PCR结果证明circCCDC66在除了正常细胞外所有测试的结肠直肠，乳腺，胰腺和宫颈癌细胞系中表达，表明circCCDC66水平升高可能是这些癌症的肿瘤发生的一般原因。细胞定位分析显示，circRNA主要存在于细胞质中，这种现象与外显子circRNA的特性一致。通过RT-qPCR发现与癌旁组织相比，癌细胞中线性CCDC66的水平较低。在用缺氧处理的癌细胞中线性CCDC66转录物的水平显著降低，而环状CCDC66转录物的水平保持不变。这说明瘤内的缺氧应激能促进circCCDC66积累循环，并且由于自身的稳定性能加强这种积累作用。临床发现circCCDC66在癌前息肉组织中高表达，且在肿瘤组织中的水平更高。在不同分期内，其在肿瘤中的水平都是高于癌旁组织。结合生存曲线，发现circCCDC66与不良预后相关，并且其表达水平是CRC检测和预后的良好预测生物标志物。

    我们设计了两种siRNA寡核苷酸以靶向独特的后裂解连接，特异性敲低circCCDC66，但不影响线性CCDC66 mRNA的水平。特异性敲低导致HCT116和HT-29中的细胞数量显著减少，其通过抑制细胞增殖介导，但不通过诱导细胞凋亡。此外circCCDC66的敲低显著减少了细胞迁移、和侵袭。随后我们使用pCIRC2（circRNA表达载体）来过表达circCCDC66，如通过RT-PCR和Sanger测序所证实的。circCCDC66的过表达显著增加了软琼脂中细胞集落的数量。此外，BrdU掺入测定显示过表达circCCDC66刺激DNA合成。

    我们使用CCDC66外显子8至10进行了miRNA靶序列分析，分析显示该区域可能被99个miRNA靶向。根据三项独立的全基因组研究GSE63119，GSE46622和GSE43793，在这99种miRNA中，62种在结肠直肠癌组织中表达。通过分析结直肠癌中有显著差异表达的癌基因及肿瘤抑制基因，37.5％的致癌基因具有CRC表达的miRNA的靶向位点，而仅有23.5％的肿瘤抑制基因含有这样的位点。我们使用过表达和敲除方法操纵circCCDC66的水平，发现作为预测的miRNA的靶标的DNMT3B，EZH2，MYC和YAP1的水平被circCCDC66过表达显著上调或通过敲低下调。相反，未被预测的miRNA靶向的EFNA4和FGF9不受影响。随后新的体外转录结合体内环化方案测试巩固了circCCDC66作为miRNA海绵的作用。另外，实验表明在过表达circCCDC66时，MYC（circCCDC66上调蛋白）其3′-UTR区活性增强（miRNAs吸附减少）。敲减circCCDC66后发现MYC mRNA表达显著减低。Rescue实验（加入miR-33b、miR-93抑制剂）后则能回复MYC mRNA水平。这些结果均表明circCCDC66能作为miRNA的海绵，调控MYC表达。

    我们将具有或不具有瞬时circCCDC66敲低的HCT116细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的背侧，并使其增殖四周。用circCCDC66敲低的HCT116接种的肿瘤的生长被显著抑制。此外，将具有或不具有瞬时circCCDC66敲低的HCT116细胞原位接种于NOD/SCID小鼠的盲肠中并使其增殖四周。对照组细胞形成的肿瘤积极地破坏平滑肌的衬里并插入肌细胞。相反，来自具有circCCDC66敲低的细胞的肿瘤通常沿平滑肌层的边缘保留明显的边界。HCC116细胞在肝脏中形成结节的能力，可能是由于肿瘤从盲肠到肝脏的转移，用circCCDC66敲低显著降低。使用对泛角蛋白特异性的抗体的免疫组织化学染色显示转移的细胞确实是上皮细胞而不是肝细胞。

    总之，我们鉴定了一组在结直肠癌中表达的新型circRNA，其中，circCCDC66与治疗结果呈负相关。 CircCCDC66可用作海绵，保护多种癌基因免受miRNA的攻击。我们发现一个circRNA含有不同miRNA的不同结合位点，揭示了circRNA在癌症恶性肿瘤中的复杂作用，并强调了研究复杂的circRNA-miRNA调节基因网络在癌症进展和治疗效果中的重要性。这是第一份彻底研究circCCDC66在人类癌症中的表达，调控，功能和临床意义的报告。

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