UV Irradiation Induces a Non-coding RNA that Functionally Opposes the Protein Encoded by the Same Gene

紫外线照射诱导lncRNA功能性地抑制由相同基因编码的蛋白质

期刊：CELL；影响因子：31.398

发表单位：弗朗西斯克里克研究所

    紫外诱导外显子可变剪接，引起ASCC3 基因形成长和短两种转录本，它们对DNA损伤后的转录恢复具有相反的作用，同时短同种型作为转录恢复所需的核非编码RNA起作用。

    转录相关的DNA损伤反应在全基因组范围内进行分析，具有很大的空间和时间分辨率。在UV照射后，观察到转录物延伸的减慢和基因活性对近似约25kb的启动子的限制。这与从长mRNA的表达向较短同种型的转变相关，并且包含更接近转录起始位点的替代末端外显子（ALE）。值得注意的是，这包括从编码蛋白质的ASCC3 mRNA转变为较短的ALE同种型，其中RNA而不是编码的蛋白质对转录的最终恢复至关重要。非编码ASCC3同种型抵消蛋白质编码同种型的功能，表明它们之间的串扰。因此，ASCC3基因表达编码和非编码转录物同种型，其在UV诱导的DNA损伤后对转录恢复具有相反的作用。

    新生RNA聚合酶II转录物的有效生产和正确加工对生命至关重要。影响转录和mRNA剪接的因素，包括DNA损伤剂，因此可以对基因表达和细胞活力产生显著影响。实际上，诸如由UV照射产生的那些庞大的DNA损伤引发RNA合成的快速关闭。它们还引发转录偶联修复，并且作为最后的手段，破坏平衡的RNA聚合酶II（RNAPII）的泛素化和降解。虽然转录起始和伸长都受到紫外线照射的影响，但变化的程度，机制和功能后果在这些过程中发生的事情仍然知之甚少。

    我们采用了5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑/测序（DRB/GRO-seq），这允许以高时间和空间分辨率测量新生RNA合成。首先用转录延伸抑制剂DRB处理细胞以将RNA PII限制于启动子近端区域。然后进行紫外线照射后，除去抑制剂以允许同步转录和通过GRO-seq进行的全基因组测序。来自PPP1R12A基因的结果作为实例显示。结果显示在未处理的细胞中，RNA PII在DRB去除后10分钟延伸基因约12kb，并且在25和40分钟后分别延伸至约38kb和约74kb。在UV暴露后25和40分钟观察到RNAPII达到约15和约20kb。此外，8,148个转录本的Meta基因谱显示，紫外线照射通常会明显减弱延长，未处理细胞40分钟后新生RNA达到约75 kb，但紫外线照射后仅约25 kb。

    我们用细胞进行GRO-seq实验，所述细胞再次以15J/m²进行UV照射，然后回收。该剂量的UV在24小时的时间过程中没有导致显著的细胞死亡。有趣的是，紫外线照射后平均2至12小时的转录本延伸率仅为约40个碱基/分钟，比未处理的细胞慢40倍以上。结果表明紫外线照射引起转录物延伸的速度显著降低，甚至在紫外线照射几小时后恢复新生RNA合成时，伸长率仍然比未处理细胞慢得多。最重要的是，转录在空间上受到长时间的限制，其中20-25kb的启动子显示出比下游区域更多的活性。

    替代性末端外显子（ALE）剪接是最常见的紫外线诱导事件。长HERC4 前体mRNA同种型包含25个外显子并且是153kb，而短HERC4前体mRNA是6.3kb，与长同种型共享前三个外显子，但包含第四个独特的末端外显子。UV照射后8小时，诱导外显子1-4。相反，外显子5-26（特异于长同种型）的表达降低，但在24小时后恢复至接近正常水平。在INTS6基因和大量其他基因上观察到类似的替代外显子表达模式。qRT-PCR证实了在UV照射后8小时，短同种型的表达增加和长同种型的伴随的较低表达。UV诱导的ALE短事件的前体mRNA长度的这种减少显著大于偶然预期，表明在UV暴露时从特别长的同种型转换为更短的同种型的一般趋势。相反，较不常见的UV诱导的长ALE同种型的中值长度约为30kb，仅比其相应的UV抑制的短同种型的中值长度长9kb。

    在UV照射后，HERC4的GRO-seq读数深度在编码短同种型的区域上增加，而其余基因中的合成被显著抑制。在UV暴露后24小时，整个基因的新生RNA合成恢复到未处理的水平，与HERC4 ALE剪接事件的动力学相关。通过比较近端和远端末端外显子的GRO-seq信号，观察到短到长转录物同种型表达比率的短暂增加，在UV后8-12小时达到峰值。这种增加与远端合成的减少相关，而不是近端外显子，并且对于UV诱导的ALE事件是特异性的。总之，迄今为止所呈现的结果表明UV照射导致转录的显著变化，延伸减慢并且RNAPII介导的RNA合成被“限制”到基因的5'末端。转录的这种基因-空间限制与包含备选的最后外显子的短转录物同种型的优先表达相关或实际上引起。

    经历UV诱导的ALE短同种型转换的84个基因的基因本体分析显示它们中的许多参与转录。我们还用最近汇编的在转录相关的DNA损伤反应中起作用的因子数据库交叉引用了这些基因。有趣的是，ASCC3脱颖而出，它在多组分筛选方法中得分最高。产生长ASCC3同种型的前mRNA是373.5kb。短ASCC3同种型长度为25kb，与前同种型共有前三个外显子，然后是独特的末端外显子。UV处理后8小时，两种同种型的外显子表达均降低。然而，在UV处理后24小时，短同种型的外显子的表达增加，而长同种型的特异性表达仍然受到抑制。ASCC3的转录特征与ALE转换相关，并且在UV照射后优先产生短ASCC3同种型。

    ASCC3是研究较少的激活信号复合物的组分。靶向ASCC复合体ASCC1和ASCC2的另外两个成员的siRNA也导致紫外线照射后新生转录增加，表明在DNA损伤后ASCC复合物作为保持转录被抑制的实体起作用。此外，两个单独的ASCC3 siRNA，以及靶向长同种型的稳定shRNA表达在DNA损伤后20小时增加转录，但不影响未处理细胞中的转录，或在UV照射后2小时观察到立即转录关闭。在2小时和20小时的差异效应是重要的，因为它表明转录在UV诱导的DNA损伤期间以两种不同的方式被抑制，即快速ASCC3非依赖性转录抑制，然后在DNA损伤反应后期继续ASCC3依赖性抑制。响应于UV暴露，ASCC3的长同种型的敲低显著降低了这种低/高转录比。我们得出结论，在ASCC复合物的背景下，ASCC3蛋白在细胞对紫外线照射的反应的晚期特异性地抑制转录。

    与siRNA pool-1形成鲜明对比的是，ASCC3 siRNA pool-2在UV照射后显著降低了转录。pool-2中的四种siRNA中的两种特异性靶向短替代转录物同种型的末端外显子独特的序列，分别将短同种型转录物水平降低79％和82％。用这些siRNA敲低既不影响未处理细胞的转录，也不影响紫外线照射后的全球转录关闭。然而，以类似于Cockayne综合征B的敲低的方式，敲低ASCC3短同种型抑制转录恢复，如通过细胞群体的新生转录特征的显著的一般变化所示。因此，在UV照射后，低转录细胞与高转录细胞的比例增加。此外，ASCC3的敲低导致对UV照射的敏感性增加。这表明UV诱导的短ASCC3 ALE同种型的表达确实在生理上是重要的，因为这种同种型是转录在UV照射后恢复所必需的。

    我们现在使用Illumina BeadArrays来比较它们在UV照射后20小时对稳定mRNA表达的影响。与UV处理的对照细胞相比，在该时间点，108个基因在短的敲除细胞中差异表达，其中大部分（73％）下调。相反，170个基因在缺乏ASCC3长同种型（长敲低细胞）的细胞中差异表达，其中64％上调。有趣的是，许多在短敲除细胞中下调的基因在长敲低细胞中上调。我们还注意到，在对照细胞中紫外线照射后20小时，受ASCC3影响最大的一部分基因实际上被大大诱导。实际上，在短的敲除细胞中很大程度上消除了五种这样的基因的表达增加。引人注目的是，所有这些基因在长敲低细胞中都被“过度诱导”，再次指出长和短ASCC3 RNA同种型的相反调节作用。

    UV诱导的短mRNA同种型含有333nt编码序列（CDS），其蛋白质产物仅为13kDa并且缺乏已知的功能结构域。除333nt CDS外，内源性ASCC3短同种型转录物还含有2.8kb 3'非翻译区（3'-UTR），这是该同种型所特有的。我们表达ASCC3短同种型，包括3'序列，其本身不含有很长的开放阅读框（ORF）。重要的是，13kDa编码的蛋白质表达至相似的水平，而不考虑转录物中3'-UTR的含量。然而，值得注意的是，与单独的CDS相反，含有3'-UTR的转录物抑制了低转录表型。这些结果表明短ASCC3同种型通过RNA介导的机制促进转录重启，而不是蛋白质。我们使用表达CDS及其3'UTR的构建体，但这次在CDS开始时插入过早停止突变。正如所料，该构建体未能产生蛋白质。然而，它拯救了缺乏短同种型的细胞中的低转录表型，表明短ASCC3同种型必须起非编码RNA的作用。

    在本报告中，我们提供了紫外线照射对转录物延伸的显著和全局影响的证据，其影响RNA加工并提供细胞调节的显著潜力。UV暴露导致转录的空间限制和较慢的延伸，结果仅有20-25kb的启动子被有效转录。这些事件共同构成了短mRNA同种型表达的转变以及许多基因（包括ASCC3）中替代性最后外显子的优先使用的基础。有趣的是，短和长同种型构成自主调节模块并且在功能上相互关联，因此通过删除另一个可以至少部分地补偿删除一个的效果。

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