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circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1ZC3H12A-Dependent Ubiquitination.

文字:[大][中][小] 2018/10/23     浏览次数:    

circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1ZC3H12A-Dependent Ubiquitination.

circRNA通过HECTD1/ZC3H12A依赖性泛素化介导二氧化硅诱导的巨噬细胞活化

 

期刊:Theranostics;影响因子:8.537

发表单位:东南大学 

 


导 读

 

    ZC3H12A可结合并稳定circHECTD1分子,在SiO2的刺激下,circHECTD1的表达显著下降,使得HECTD1得以保留和增高,介导了ZC3H12A的泛素化降解作用,引起巨噬细胞M1型活化状态和肺纤维化等病理进程。

 


摘 要

 

    二氧化硅(SiO2)向肺细胞的吞噬作用引起炎症级联,导致成纤维细胞增殖和迁移,随后出现纤维化。通过研究健康供者和患者以及RAW264.7巨噬细胞系的肺泡巨噬细胞原代培养物用于探讨circHECTD1HECT结构域E3泛素蛋白连接酶1)在巨噬细胞活化中的功能。结果表明,SiO2降低了circHECTD1水平,同时增加了HECTD1蛋白表达;circHECTD1HECTD1通过泛素化参与SiO2诱导的巨噬细胞活化;SiO2激活的巨噬细胞通过circHECTD1/HECTD1通路促进成纤维细胞的增殖和迁移。

 


研究背景

    矽肺病是一种职业病,由长期暴露于高含量含有过量的游离二氧化硅(结晶二氧化硅)的粉尘引起,发病率表现出个体间的差异,这可能是由于个体炎症反应的变化。通过肺泡巨噬细胞对二氧化硅颗粒的吞噬作用引发矽肺病。这些巨噬细胞释放出各种氧化剂和细胞因子,它们在疾病的发展和进展中起着至关重要的作用。因此,需要研究circRNA在炎症和纤维化的进展和治疗中的作用。

 


结 果


1   暴露于SiO2的小鼠肺中circRNA的差异表达

    在本研究中,我们对已建立的SiO2诱导的矽肺小鼠模型进行了circRNA微阵列分析。如图A所示,通过层次聚类显示,circRNA在生理盐水(NS)和SiO2处理的小鼠的肺中表达。我们鉴定了与NS组相比在SiO2组中差异表达的120circRNA中有73个上调,47个下调mmu_circ_0000375特别令人感兴趣,因为其宿主基因HECTD1(候选E3泛素连接酶)可能通过遍在蛋白化参与SiO2诱导的炎症和纤维化。如图1B-C中所示的火山和散点图所示,在NS组和SiO2组中小鼠的肺中circHECTD1表达不同

 


2   SiO2暴露后巨噬细胞中circHECTD1的表达

    肺泡巨噬细胞(AMO)是矽肺的效应细胞,因此,在小鼠RAW264.7巨噬细胞中测量SiO2circHECTD1表达的影响。通过使用趋异引物的qRT-PCR实验观察到RAW264.7细胞暴露于SiO2 24小时后,circHECTD1表达降低。这些结果在荧光原位杂交(FISH)测定中得到证实,其中circHECTD1主要在RAW264.7细胞的细胞质中检测到。随后通过检测SiO2处理的小鼠BALF分离的巨噬细胞中的circHECTD1水平证实了circHECTD1表达的降低。

 


3   circHECTD1响应于SiO2暴露而介导巨噬细胞活化

    circHECTD1慢病毒转染到RAW264.7细胞中使其过表达,RAW264.7细胞中circHECTD1的转染恢复了暴露于SiO2 48小时诱导的细胞活力的降低。在SiO2处理的RAW264.7细胞中测量巨噬细胞的各种表型标志物的水平,例如NOS2M1),ARG1M2a)和SOCS3M2c),发现SiO2诱导NOS2ARG2SOCS3表达的显著增加。circHECTD1慢病毒转染减弱了用SiO2处理的巨噬细胞的表型转化消除了SiO2诱导的RAW264.7细胞迁移的增加,证实了circHECTD1SiO2诱导的巨噬细胞活化中的作用。

 


4   ZC3H12A参与circHECTD1介导的响应于SiO2的巨噬细胞活化

    之前已表明ZC3H12A/MCPIP1可介导巨噬细胞活化和成纤维细胞增殖/迁移,尚不清楚circHECTD1是否可以介导ZC3H12A影响巨噬细胞活化。ZC3H12A质粒减弱了由SiO2诱导的M1M2标记物的增加,而ZC3H12A siRNA加剧了由SiO2诱导的M1M2标记物的增加。此外,我们采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)测定来确定circHECTD1ZC3H12A之间是否存在相关性,结果表明ZC3H12AcircHECTD1相互作用但不与HECTD1 mRNA相互作用

 


5   SiO2诱导RAW264.7细胞中的HECTD1表达

    我们首先检测在SiO2处理的RAW264.7细胞中HECTD1蛋白的水平,发现其呈现快速且持续的增加,免疫染色证实了这一发现。此外,HECTD1 mRNA的水平显示出快速和瞬时的增加并且在SiO2暴露后3小时达到峰值。随后我们建立小鼠矽肺模型,免疫组织化学分析揭示了肺中巨噬细胞的积累,如特异性巨噬细胞标记物F4/80的增加所示,表明发生了炎症级联反应。在SiO2暴露后HECTD1表达在小鼠肺中上调,并且HECTD1与巨噬细胞标记物F4/80的共定位也增加,证实了先前的发现。

 


6   circHECTD1介导HECTD1以响应于SiO2暴露而调节RAW264.7活化

    circHECTD1慢病毒转染RAW264.7细胞不影响HECTD1 mRNA水平但却抑制了HECTD1蛋白的表达,突出了circHECTD1HECTD1之间的联系。基于CRISPR/Cas9系统,用HECTD1 CRISPR激活质粒(ACT)转染和用CRISPR双切口酶质粒(NIC)转染分别上调和下调HECTD1的表达。ACT增加ARG1SOCS3的表达但不增加NOS2,而NIC增加NOS2表达并降低ARG1SOCS3的表达,HECTD1被认为参与由SiO2诱导的circHECTD1介导的表型变化ACT治疗也降低了RAW264.7细胞的活力,而NIC治疗恢复了它们的生存能力。

  


7   HECTD1响应于SiO2通过ZC3H12A遍在蛋白化介导巨噬细胞活化

    免疫沉淀测定揭示了HECTD1ZC3H12A之间的相互作用。通过检测蛋白酶体抑制剂MG-132ZC3H12A的作用,发现RAW264.7细胞的存活率以剂量依赖性方式降低。此外,ZC3H12A表达在生理暴露于MG-132后升高,但在SiO2处理后未升高。随后,检测HECTD1K48-遍在蛋白表达的影响。HECTD1的过表达增强了K48-遍在蛋白的表达。HECTD1敲低减弱了K48-遍在蛋白的表达,而ZC3H12A表达的作用与K48-遍在蛋白的作用相反。此外,circHECTD1慢病毒的转染降低了K48-遍在蛋白的表达。

 


8   SiO2诱导的巨噬细胞中HECTD1的上调参与成纤维细胞的活化和迁移

    接下来,我们将存在或不存在ACTNIC处理(条件培养基)的暴露于SiO2RAW264.7细胞的上清液应用于成纤维细胞,并测量成纤维细胞的增殖和迁移。来自NIC处理的RAW264.7细胞的上清液显著抑制SiO2诱导的细胞迁移,而来自ACT处理的RAW264.7细胞的上清液增加细胞迁移。此外,在存在或不存在ACTNIC(条件培养基)的情况下生长的正常生理RAW264.7细胞的上清液对成纤维细胞迁移发挥相同的作用。来自NIC处理的RAW264.7细胞的上清液引起对SiO2诱导的成纤维细胞活化的显著抑制,而来自ACT处理的RAW264.7细胞的上清液引起成纤维细胞活化增加

 


9   来自患有矽肺病的患者的巨噬细胞中HECTD1表达增加

    我们对临床矽肺患者的检查证实了我们的发现,与来自健康供体的患者相比,来自矽肺患者的BALF的巨噬细胞中HECTD1水平显著增加。此外,我们观察到HECTD1与矽肺患者的肺组织中的巨噬细胞标记物F4/80之间的共定位。基于这些结果,来自矽肺患者的巨噬细胞显示HECTD1水平增加并且经历细胞凋亡和活化,从而促进矽肺病的发展

 


讨 论

  

    circRNA是广泛表达的非编码RNA非常稳定,但是circRNA的功能知之甚少。在这里,我们的研究阐明了SiO2诱导的巨噬细胞活化与circHECTD1/HECTD1通路之间的联系,从而为HECTD1在开发治疗矽肺的新治疗策略中的潜在用途提供了新的见解。


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