Genome-scale Activation Screen Identifies a LncRNA Locus that Regulates a Gene Neighborhood

基因组规模激活筛选识别调节基因邻域的LncRNA基因座

期刊：Nature；影响因子：41.577

发表单位：麻省理工学院

    使用基因组规模筛选的方式可以系统地识别影响特定细胞过程的许多lncRNA基因座，并促进表征这些基因座的生物学功能。

    我们利用基因组规模的CRISPR-Cas9激活筛选发现了11个新的lncRNA基因座，在募集活化剂后，每个基因座介导BRAF抑制剂对黑色素瘤的抗性。对一种候选物（称为EMICERI）的详细分析显示，其转录激活导致四种相邻蛋白质编码基因的剂量依赖性激活，其中一种赋予抗性表型。

    哺乳动物基因组包含数千个转录长链非编码RNA（lncRNA）的基因座，其中一些已知在多种细胞过程中发挥关键作用。LncRNA基因座可通过多种机制促进细胞调节：虽然有些编码非局部（反式）作用的RNA，但新出现的证据表明许多lncRNA基因座在局部（顺式）起作用，例如，通过lncRNA启动子的功能，lncRNA转录的过程，或lncRNA转录本身在调节附近基因的表达。尽管它们具有潜在的重要作用，但鉴定功能性lncRNA基因座并区分这些和其他机制仍然具有挑战性。

    我们以前使用Cas9协同激活介质（SAM）来筛选蛋白质编码基因，这些基因赋予黑素瘤细胞对BRAF抑制剂维罗非尼的抗性，使其成为高通量筛选功能性lncRNA基因座的理想表型。我们设计了基因组规模的sgRNA文库，用于转导A375（BRAF（V600E））黑色素瘤细胞，在2μM 维罗非尼或对照（二甲基亚砜，DMSO）中培养，并在药物处理14天后测序sgRNA的分布。RIGER分析鉴定了16个显著富集的候选基因座，先前都未在功能上表征。我们在激活具有最强效应的11个基因座中的每一个时进行RNA测序，并且发现基因表达的全局变化与维罗非尼抗性一致，支持这些基因座与筛选表型的功能相关性。

    接下来，我们分析这些基因座的激活可能导致抗性的机制，其可包括lncRNA转录物的非局部功能；lncRNA转录物的局部功能或其转录；lncRNA基因座中DNA元件的局部功能；SAM的局部功能四种方式。为了集中于机制可能需要lncRNA或其转录的基因座，我们激活了每个基因座并检测到这11个基因座中的6个的稳健的lncRNA转录物上调。剩余的5个基因座可以通过除了激活lncRNA转录物之外的机制起作用。

    我们通过随机慢病毒整合过表达编码每个lncRNA的cDNA，并且没有发现任何影响耐药性，表明这些位点可能不通过非本地功能起作用。在6个基因座中的5个，我们发现SAM靶向导致1到8个附近蛋白质编码基因的差异表达。例如，NR_109890的激活上调其邻近基因EBF1，并且TCONS_00015940的激活导致4种相邻蛋白质编码基因的剂量依赖性上调。总之，这些分析表明，没有一个lncRNA基因座似乎通过产生反式作用RNA来赋予维罗非尼抗性；相反，基因座可以调节一个或多个附近基因的表达。

    我们发现TCONS_00015940实际上由两个单独的转录本组成。我们将这些转录物命名为“EQTN MOB3B IFNK C9orf72增强子RNA I”，或EMICERI和EMICERII。为了确定EMICERI基因邻域的协调上调如何导致维罗非尼抗性，我们过表达了4种蛋白质编码基因中的每一种的cDNA以及来自随机整合的慢病毒的EMICERI或II lncRNA。结果发现只有MOB3B过表达导致维罗非尼抗性。我们发现MOB3B过表达下调LATS1以激活Hippo信号传导通路。我们将我们的观察扩展到我们最初筛查的细胞系之外，通过显示EMICERI和MOB3B的激活在另外两个敏感的黑素瘤细胞系中赋予了维罗非尼耐药，并与来自癌症基因组图谱的黑素瘤患者维罗非尼耐药的基因表达特征相关。总之，这些结果表明EMICERI基因座的激活通过MOB3B的上调和随后的Hippo信号传导通路的激活赋予了维罗非尼抗性。

    将SAM靶向共享的EMICERI/MOB3B启动子可能仅通过直接激活MOB3B来赋予抗性。我们使用CRISPR-dCas9、反义寡核苷酸（ASO）转染、携带3个串联多腺苷酸化信号（pAS）插入的克隆A375细胞系三种扰动方法来干扰EMICERI转录并观察对MOB3B的影响，结果表明EMICERI的转录是完全激活MOB3B所必需的，证实EMICERI是一种功能性非编码基因座，其激活四个相邻的蛋白质编码基因并有助于筛选表型。接下来我们确定EMICERI转录本身的功能还是其转录过程才是MOB3B活化所必需的。我们发现靶向MOB3B TSS下游的dCas9成功阻断了MOB3B转录并降低了EMICERI和其他相邻基因的表达；类似地，在SAM激活的背景下，靶向MOB3B内含子的ASO减少了MOB3B和EMICERI的激活。总之，EMICERI和MOB3B扰动实验表明，lncRNA（EMICERI）和mRNA（MOB3B）的转录在正反馈机制中相互调节，然后可能通过与转录相关的一般过程激活更广泛的基因邻域。

    理解基因组调控逻辑的主要挑战是鉴定功能性lncRNA基因座并表征其机制。在这里，我们证明基因组规模的激活筛选能够系统地识别影响特定细胞过程的许多lncRNA基因座，促进了解这些关键基因座的功能和机制的努力。这种非编码功能获取筛查方法在其他环境中的进一步应用，以及功能丧失筛查方法和我们的表征策略，将有助于阐明这些知之甚少的参与者在发育和疾病中的复杂作用。

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