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MIR100 host gene-encoded lncRNAs regulate cell cycle by modulating the interaction between HuR and its target mRNAs

文字:[大][中][小] 2018/10/23     浏览次数:    

MIR100 host gene-encoded lncRNAs regulate cell cycle by modulating the interaction between HuR and its target mRNAs

MIR100宿主基因编码的lncRNA通过调节HuR与其靶mRNA之间的相互作用来调节细胞周期

 

期刊:NUCLEIC ACIDS RESEARCH;影响因子:11.561

发表单位:伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校

           


导 读

 

    MIR100HG可能作为HuR及其靶mRNA的结合平台,从而调节HuR和靶mRNA相互作用。



摘 要

 

    目前,大多数lnc-miRHG的细胞功能尚不清楚。我们证明了核富集的lnc-miRHG在细胞周期进程中的miRNA非依赖性作用。在人体细胞中消耗MIR100HG编码的lncRNA导致异常的细胞周期进程,而不改变MIR100HG内编码的miRNA的水平。MIR100HGHuR/ELAVL1以及几种HuRmRNA相互作用,MIR100HG耗尽的细胞显示HuR与其三种靶标mRNA之间的相互作用减少,表明MIR100HG促进HuR和靶mRNA之间的相互作用。我们的研究发现MIRHG编码的lncRNA在调节RNA结合蛋白活性中发挥了新的作用,从而强调了确定人类基因组中存在的数百种lnc-miRHG功能的重要性。



研究背景

    LncRNA基于其基因组位置,表达模式或功能进行细分。一些lncRNA在其外显子或内含子序列中含有miRNA,因此被称为miRNA-宿主基因lncRNAlnc-miRHG)。已经充分研究了由lnc-miRHG加工的miRNA的生物发生和功能。此外,几种lnc-miRHGs在疾病中表现异常,因此可作为重要的诊断或预后标志物。然而,尚不清楚在miRNA加工过程中从pri-miRHG加工的稳定且适当剪接的lnc-miRHG池是否具有任何重要的细胞功能,或仅作为miRNA加工的非功能性副产物。迄今为止很少有研究确定了lnc-miRHGmiRNA非依赖性作用。在本研究中,我们发现多个lnc-miRHG,包括MIR100HG,在细胞周期的特定阶段差异表达。机制研究表明,MIR100HG促进HuR与其靶mRNA的一部分之间的相互作用。

 


结 果


1   MIR100HG编码的lncRNA在细胞周期的G1期显示升高的水平

    MIR100HG产生几种MIR100HG lncRNA的同种型,这是由于选择性剪接和差异启动子的使用。为了测试细胞周期中剪接的MIR100HG的相对水平,我们使用外显子-外显子连接引物对在同步的U2OS细胞的RNA样品中进行RT-qPCR分析以扩增外显区域由大多数MIR100HG同种型共有。与我们在pri-miR100HG RNA的情况下观察到的相似,即使是剪接的MIR100HG也显示出升高的水平,特别是在G1期间。靶向最后一个外显子的外显子引物也显示相同的表达模式。发现MIR100HG是主要核和相对稳定的lncRNA,半衰期约为75分钟。通过观察MIR100HG在正常细胞与癌细胞中的表达情况,发现G1期上调的MIR100HG倾向于在癌细胞中表现出升高的表达,并将MIR100HG鉴定为非编码转录本。

 


2   MIR100HG调节细胞周期进程

    为了确定MIR100HG参与细胞增殖,我们进行了流式细胞仪分析,发现MIR100HG耗尽的U2OS细胞显示G2/M群体水平升高,同时G1群体减少。使用siRNA耗尽MIR100HG的细胞也显示G2/M阻滞而不影响成熟miR-100水平,证实了细胞周期表型的特异性。最后,我们通过在耗尽内源性MIR100HG的细胞中过表达全长剪接的MIR100HG同种型来进行拯救实验。我们观察到MIR100HG cDNA可以部分地拯救G2/M阻滞表型。除G2/M阻滞外,二倍体成纤维细胞(WI-38)中MIR100HG的消耗也导致S期进展缺陷。然后我们在对照和MIR100HG耗尽的U2OS细胞中进行转录组微阵列。我们在MIR100HG耗尽的细胞中鉴定了722个下调基因和另外577个上调基因。分析显示,这些基因其表达水平在MIR100HG耗尽的细胞中发生改变,在控制细胞生长的关键通路中发挥重要作用,包括细胞周期,细胞增殖,细胞死亡和存活,进一步支持在MIR100HG耗尽的细胞中观察到的细胞表型

 


3   MIR100HGHuR相互作用并影响HuR与其靶mRNA的相关性

    我们使用生物素标记的MIR100HG进行了U2OS核提取物的RNA亲和力下调,进行了质谱分析。然后通过生物素RNA pull-down,免疫印迹测试,证实了MIR100HGRBP(如HuRPTBPUF60)之间的相互作用。HuR可控制多种生物学事件,包括细胞周期,细胞凋亡和癌症进展。因此,我们研究了HuRMIR100HG之间相互作用的功能意义。我们首先通过细胞周期同步细胞提取物中的HuR核糖核蛋白(RNP)免疫沉淀(RIP)分析,然后RT-qPCR证实了HuR与内源性MIR100HG之间的相互作用。

    我们进行HuR RIP,然后使用来自对照和MIR100HG耗尽的U2OS细胞的RNA进行微阵列。有趣的是,敲除MIR100HG显著降低了HuR与其几种靶mRNA的相关性。此外,通过在对照和MIR100HG耗尽的细胞中进行HuR-RIP,然后进行RT-qPCR,我们证实了HuR与其几种靶mRNA的相关性降低。同时,MIR100HG消耗不改变HuR与几种组成型表达的持家基因mRNA的关联。我们的结果意味着MIR100HG正向调节HuR与其几种靶mRNA的关联

 


4   MIR100HG内的富含U的结构域调节MIR100HGHuR RNP复合物之间的相互作用

    我们使用计算预测工具来找到与MIR100HG具有序列互补性的mRNA。根据预测并通过HuR RIP分析,我们将24mRNA鉴定为HuR相互作用的mRNA。我们的结果表明HuRMIR100HG可以结合几种共有的靶mRNA。有趣的是,大多数预测mRNAMIR100HG之间的相互作用是通过MIR100HG最后一个外显子中存在的第一个富含U的重复序列发生的。接下来设计了一种20nt长的21-O-甲氧基乙基反义寡核苷酸(MOE; MOE-100)来测定U重复区域是否对促进lncRNA-mRNA相互作用,结果表明,存在于MIR100HG3′末端的富含U的序列促进其与HuRmRNA的特定成员的相互作用。此外,我们还确定了富含U的序列元素是否也促进了MIR100HGHuR之间的相互作用。为此,我们使用生物素标记的MIR100HG在细胞提取物中进行RNA亲和力pull-down,所述MIR100HG与生物素标记的对照(SCR)或富含AMOEMOE-100)寡核苷酸预孵育,然后进行免疫印迹。HuR仅在SCR-MOE预孵育的提取物中显示出与MIR100HG的强相互作用,而不是在富含AMOE预孵育的提取物中,表明MIR100HG利用富含U的基序与HuRHuRmRNA相互作用



讨 论

    通常认为MIRHG的作用是产生miRNA,并且从MIRHG初级转录物处理的lncRNA不会发挥任何重要作用。然而,最近很少有研究报道了由lnc-miRHGs发挥的miRNA独立作用。这些研究强调了这类lncRNA的功能意义,这在以前被忽略,并表明了解MIRHG编码的lncRNA所起的独立作用的重要性。我们的研究证明了MIR100HG参与细胞周期及其在调节RBP与其靶mRNA的亲和力中的作用,这进一步强调了确定数百种lnc-miRHG在人类基因组中的作用的重要性。

 

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