H19 Induces Abdominal Aortic Aneurysm Development and Progression

H19诱导腹主动脉瘤的发展和进展

期刊：Circulation；影响因子：18.88

发表单位：德国慕尼黑技术大学 

    lncRNA H19是一种新的SMC在AAA发展和进展中存活的调节因子，抑制其表达可能作为主动脉瘤疾病的新型分子治疗靶点。

    lncRNA已成为各种生物过程和疾病中的关键分子调节剂。在这里，我们寻求识别和功能表征lncRNAs作为腹主动脉瘤（AAA）发展的潜在介质。在体内利用位点特异性反义寡核苷酸（LNA-GapmeRs）对H19进行实验性敲低，显著限制了两种模型中的动脉瘤生长。上调的H19与进展性动脉瘤中的平滑肌细胞（SMC）含量和SMC凋亡相关。H19的体外敲低显著降低了培养的人主动脉SMC的凋亡率，而H19的过表达具有相反的作用。定制的转录因子阵列将缺氧诱导因子1-α（HIF1α）鉴定为主要的下游效应子。另外，H19通过将转录因子特异性蛋白1（Sp1）募集到启动子区来诱导HIF1α的转录。

    腹主动脉瘤（AAA）是腹主动脉的局部扩大，直径大于3厘米，或超过正常大小的1.5倍，死亡率高达80％。动脉瘤的无症状特征使其评估具有挑战性。不幸的是，到目前为止还没有确定可以限制其进展或人类破裂风险的有效药理学方法。临床上，唯一可用的治疗选择仍然是外科手术，包括扩张主动脉的开放性或血管内主动脉修复术（OAR或EVAR）。获得对驱动AAA发展和进展的细胞机制和调节网络的更好理解对于鉴定新的治疗靶标是必不可少的。

    我们在血管紧张素II（AngII）/ApoE-/-小鼠模型中进行RNA测序以鉴定动脉瘤发展期间的失调。在泵植入后7天收获来自AngII处理的小鼠（n=4）或假对照（n=4）的腹主动脉组织。当使用PPE输注在第二个实验性AAA小鼠模型中交叉检查上调的转录物时，H19和另外两个lncRNA被鉴定为与模型无关的lncRNA。通过AngII诱导的AAA样品中的RT-qPCR与对照相比证实了所有三种lncRNA的上调，其中H19上调最显著（图1b，c）。利用位点特异性反义寡核苷酸（LNA-GapmeRs）对H19进行全身体内敲低显著限制了两种鼠模型中的动脉瘤生长（图1d，e），使用错配的乱序寡核苷酸作为相关对照。原位杂交表明H19在未消化的非扩张主动脉的内侧SMC和外膜成纤维细胞中表达。在AngII输注后，H19表达在扩张的主动脉组织中的内侧SMC中显著升高。通过用GapmeRs抑制H19来消除这种增加。这些数据表明H19可能通过影响SMC动力学参与AAA的发展和进展。

    与我们的体内数据一致，AngII能够在培养的主动脉SMC中稳健地诱导H19。AngII处理进一步诱导细胞凋亡，同时降低SMC的增殖率。这些作用均被H19敲低减弱，表明H19在AAA相关（AngII）条件下对SMC凋亡的调节作用。值得注意的是，这种促凋亡作用只能在较晚的时间点（48小时）观察到，而不是在早期的急性反应期（8小时）观察到。为了进一步评估H19调节在SMC中的细胞效应，我们使用了动态活细胞成像系统。首先，我们要么用LNA-GapmeRs抑制H19，要么在培养的人主动脉平滑肌细胞（hAoSMCs）中用pcDNA-H19依赖性过表达诱导H19。H19的过表达导致细胞凋亡增强和SMC的增殖以时间依赖性方式降低。敲除H19抑制SMC凋亡，但未观察到对增殖率的显著影响。

    越来越多的研究表明，H19可能作为miR-675的储库，其嵌入H19转录物的第一个外显子中。因此，我们评估了miR-675在H19介导的对SMC的作用中的作用。 培养的hAoSMC用H19野生型载体（H19wt）或H19突变体转染，缺失miR-675（H19 mut），并随时间监测。H19 mut和H19 wt均诱导细胞凋亡并减少SMC的增殖。除此之外，通过qRT-PCR在AngII诱导的AAA中未观察到miR-675表达的显著差异。与H19不同，miR-675在来自患有AAA的人类患者的组织样品中或在动脉瘤发育的两个实验鼠模型中的任一个中都没有显著失调。因此，在AAA发展过程中，H19对SMC的作用似乎与miR-675无关。

    为了探究H19如何调节SMC细胞凋亡，我们提出H19可能通过转录因子的改变来影响分子过程。基于对调节RNA元件的计算机分析，我们鉴定了包括HIF1α在内的几种预测与H19相互作用的转录因子，然后使用定制设计的RNA阵列分析显示HIF1α是唯一的差异调节因子。为了证实HIF1α介导H19的作用，我们使用siRNA诱导的HIF1α抑制。HIF1α的mRNA和蛋白质水平均被显著阻断。有趣的是，H19过表达以及AngII治疗显著增加了HIF1α的表达并因此在SMC中凋亡。通过抑制H19或HIF1α沉默可以消除这种作用。在HIF1α抑制后，SMC中的H19水平保持不变。重要的是，促凋亡蛋白Bcl-2相关X（BAX）显示与HIF1α相同的模式，而抗凋亡介质B细胞CCL/淋巴瘤2（BCL2）显示相反的趋势，表明 AngII/H19诱导的SMC凋亡依赖于HIF1α表达的变化。

    我们用qRT-PCR评估了小鼠和人AAA样品中HIF1α和凋亡相关基因的表达。如所预期的，H19，HIF1α和BAX均显著增加，而抗凋亡蛋白BCL2在鼠AngII和PPE模型以及人主动脉瘤中显著降低。H19的敲低充分抑制了HIF1α的表达并显著限制了SMC凋亡。同样，在人AAA样品的SMC层中观察到上调的H19和HIF1α的共定位以及与细胞凋亡的相关性。H19和HIF1α在两种小鼠AAA模型中一致诱导，而已知HIF1α下游靶标的特定变化在不同的AAA模型中不一致，表明这些变化可能与模型相关而不是HIF1α依赖性。最后，通过PPE灌注在野生型（WT）或Ldlr-/-Yucatan小型猪中诱导AAA，类似于鼠模型。与假手术组相比，H19的表达显著上调，同时PPE诱导的AAA中HIF1α的表达增强。

    我们利用原位杂交（ISH）和邻近连接测定（PLA）评估H19和HIF1α之间的物理相互作用，，其中一旦两个分子达到非常接近（<40nm）就可以检测到放大的信号，这被认为是它们相互作用的证据。事实上，AngII治疗以及H19过表达大大增强了H19和HIF1α之间的相互作用，主要在细胞质中。HIF1α是胚胎心血管发育所必需的，因此被认为是缺氧期间细胞存活的必要条件。在此过程中，诱导的HIF1α转移到细胞核中并激活参与减少缺氧损伤的许多基因的转录。氯化钴（CoCl2）是一种成熟的HIF1α的化学诱导剂，成功地增加了HIF1α的积累，并触发其易位进入细胞核。有趣的是，H19减弱了易位并将HIF1α滞留在细胞质内，这表明H19结合细胞质HIF1α的这种直接相互作用可以刺激SMC凋亡并增强AAA进展。

    我们设计了生物素标记的ISH探针，靶向HIF1α启动子区域，并利用基于PLA的相互作用检测方法在细胞核中证实了Sp1和H19之间的相互作用模式。然后使用在启动子区域含有HIF1α wt或Sp1结合位点突变体的荧光素酶报告基因测定法。观察发现Sp1和H19过表达的组合处理显著增加了转录活性，表明H19募集并促进Sp1与HIF1α启动子区域的结合。在Sp1抑制剂mithramycine A存在下，这些作用被消除，进一步支持Sp1在这种情况下的转录作用。此外，HIF1α启动子突变体的荧光素酶测定表明HIF1α启动子区域中的两个Sp1结合位点对于这些作用是必需的。此外，使用LongTarget工具分析预测H19-HIF1α结合模式。H19中该区域的缺失保留了促凋亡能力，但未能增强HIF1α转录活性。这些数据表明H19通过将Sp1募集到其启动子区域来增强HIF1α转录。最后，染色质免疫沉淀（ChIP）测定能够证实HIF1α启动子中Sp1和H19的占据。

    总之，我们在AAA发展，其进展和终末期疾病中鉴定了功能相关的lncRNA。在SMC的细胞核中，增强的H19与HIF1α的启动子区域结合并募集转录因子Sp1，其增强HIF1α的表达。同时，H19与HIF1α蛋白相互作用并将其保留在细胞质内，作为可阻断促存活信号传导的支架。增加的细胞质HIF1α直接与Mdm2相互作用并阻止Mdm2介导的p53减少，从而导致BAX升高和BCL2水平降低。这会引发SMC凋亡并加速AAA的发展和进展。

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