Long-noncoding RNA Atrolnc-1 promotes muscle wasting in mice  with chronic kidney disease

长链非编码RNA Atrolnc-1促进慢性肾病小鼠的肌肉萎缩

期刊：J Cachexia Sarcopenia Muscle；影响因子：12.511       

发表单位：上海交通大学医学院附属新华医院              

   lncRNA Atrolnc-1与内源性NF-κB抑制剂ABIN-1相互作用，这种结合阻碍了ABIN-1抑制功能，导致NF-κB活化，从而增加MuRF-1表达和肌肉蛋白水解。

   慢性肾病（CKD）通常与恶病质相关，恶病质是导致骨骼肌萎缩和不利预后的病症。尽管已经深入研究了导致恶病质的机制，但生物学知识和技术的进步促使我们在理解这种疾病的发病机理方面取得进展。我们的研究结果提供证据表明lncRNAs启动了肌肉萎缩的病理生理过程。Atrolnc-1和NF-κB信号传导之间的相互作用调节CKD中的肌肉质量和蛋白水解以及可能的其他分解代谢条件。

   肌肉萎缩被定义为骨骼肌质量的减少，这是慢性疾病预后的重要指标。在CKD或其他分解代谢条件下肌肉萎缩是一个复杂的过程，由于IGF-1 /胰岛素信号传导受损，代谢应激，糖皮质激素升高和炎症而发生。虽然在理解肌肉蛋白质丢失方面取得了重大进展，背后的分子和细胞机制仍在被发现。在目前的研究中，我们致力于发现恶病质相关的lncRNA，并确定它们在肌肉萎缩中的功能。我们鉴定了lncRNA，1110038 B12Rik在肌肉萎缩的各种小鼠模型的肌肉中持续上调。由于这种lncRNA的过表达刺激了MuRF-1的表达和肌肉萎缩，我们将其改名为萎缩相关的长非编码RNA-1（Atrolnc-1）。我们发现Atrolnc-1与ABIN-1相互作用，导致NF-κB活性增强和MuRF-1表达增强。这些结果为MuRF-1调节增加了新的复杂层，并扩展了肌肉萎缩期间蛋白水解的转录调节谱。

   为了确定lncRNAs是否在肌肉萎缩中差异表达，我们在来自三种分解代谢条件（包括CKD，饥饿（STV）和癌症）的小鼠模型的四头肌中进行了基于PCR的lncRNA阵列（RT2 lncRNA PCR Array）分析。我们发现几种lncRNA在具有分解代谢条件的小鼠的肌肉中差异表达（图1A）。我们进一步确定了来自三种小鼠分解代谢模型的萎缩肌肉中8种lncRNA的表达同时升高，其中1110038 B12Rik是增强最强的lncRNA；同时，来自三种分解代谢模型的肌肉中9种lncRNA的表达被下调（图1B）。使用实时定量PCR，我们证实1110038B12Rik在骨骼肌中大量表达，并且其表达在由CKD，STV和癌症引起的萎缩肌肉中显著增加（图1C）。因为1110038 B12Rik响应肌肉萎缩而增加。

   我们首先研究了胰岛素如何影响血清饥饿的C2C12肌管中Atrolnc-1的表达，无论其是否含有胰岛素。通过血清耗竭24小时显著增加Atrolnc-1表达，而添加胰岛素或IGF-1消除了由血清耗竭刺激的Atrolnc-1水平。通过分析Atrolnc-1的启动子区域，我们发现转录因子C/EBP-α有许多结合位点。这促使我们研究C/EBP-α是否促进Atrolnc-1的表达，我们将荧光素酶报告基因（Luc-Atrolnc-1）含有Atrolnc-1启动子的质粒转染到C2C12成肌细胞中，24小时后，用血清耗竭或C/EBP-α过表达处理细胞。如所预期的，C/EBP-α的血清耗竭或过表达强烈刺激C2C12细胞中的Atrolnc-1启动子活性。然后我们进行染色质免疫沉淀测定以证实C/EBP-α与Atrolnc-1的启动子区域相关。血清耗竭富集了在抗C/EBP-α抗体下拉的免疫沉淀物中含有C/EBP-α结合位点的启动子DNA片段。值得注意的是，添加胰岛素（2μg/mL）降低了免疫沉淀物中启动子DNA片段的量，表明胰岛素阻断了C/EBP-α与Atrolnc-1启动子的结合。这些结果表明，CKD或STV小鼠中发生的抑制胰岛素信号传导刺激C/EBP-α促进肌肉中Atrolnc-1的表达。

   我们构建了携带Atrolnc-1 cDNA或shRNA的两种AAV1（腺相关病毒同种型1，其与骨骼肌细胞具有高亲和力），分别用于过表达或敲除Atrolnc-1。用载有Atrolnc-1 cDNA的AAV1转染C2C12肌管48小时，与用对照AAV1转染的细胞相比，Atrolnc-1 RNA增加3倍。我们发现Atrolnc-1的过表达没有改变蛋白质合成的速率，但是与用对照AAV1转染的肌管的结果相比，显著增加了肌管中蛋白质降解的速率。

    当AAV1携带shRNA转染的C2C12肌管48小时时，与用对照shRNA转染的肌管相比，它有效地降低了Atrolnc-1 RNA的水平。在Atrolnc-1敲低后，蛋白质合成速率没有受到显著影响。我们还发现蛋白质降解不受影响，然而，当用血清耗尽处理肌管时，通过敲低Atrolnc-1显著抑制蛋白质降解的速率。值得注意的是，Atrolnc-1敲低在用无血清培养基培养后没有改变C2C12肌管中p-Akt的水平。这些结果表明Atrolnc-1刺激肌肉蛋白质降解。

   我们使用C2C12肌管中的'肌生成和肌病PCR阵列'来分析基因表达。首先，我们用Atrolnc-1敲低检测了这些基因在肌管中的表达，并发现3个基因被上调，而11个基因响应于Atrolnc-1敲低而下调。在下调基因中，MuRF-1，介导肌肉蛋白水解的主要蛋白E3连接酶显著减少。我们在具有Atrolnc-1过表达的肌管中进行相同的PCR阵列，超过20％的测试基因被上调，包括MuRF-1。使用蛋白质印迹，我们证实Atrolnc-1过表达显著刺激了C2C12肌管中MuRF-1的表达。值得注意的是，我们发现Atrolnc-1在肌管中的表达随着血清耗竭（<6 h）而迅速增加，比诱导MuRF-1早得多，表明Atrolnc-1可能在诱导MuRF-1表达中起到因果作用。这些结果表明Atrolnc-1在转录水平上调节MuRF-1表达。通过使用KEGG途径富集分析，我们发现NF-κB信号传导是响应Atrolnc-1过表达或敲低的最丰富的途径之一。使用蛋白质印迹，我们检测到在Atrolnc-1过表达48小时后C2C12细胞的核部分中NF-κB（p65）显著增加。NF-κB活性测定进一步证实Atrolnc-1的过表达激活C2C12肌管中的NF-κB信号传导。这些结果表明Atrolnc-1可以促进肌肉细胞中的NF-κB活性。

   我们进行了RNA原位杂交发现Atrolnc-1 RNA位于C2C12细胞的细胞质和细胞核中，表明其在基因调控中具有多重潜在作用。然后我们使用C2C12肌管的细胞质或核提取物进行RNA pull-down测定以及质谱法以鉴定可能与Atrolnc-1相互作用的蛋白质。其中一个是细胞质蛋白质ABIN-1，一种据报道抑制NF-κB信号的蛋白质。我们通过使用针对ABIN-1的抗体的免疫印迹证实了ABIN-1和Atrolnc-1之间相互作用的特异性。值得注意的是，我们观察到来自CKD小鼠的肌肉中Atrolnc-1和ABIN-1之间的相互作用增加，表明CKD可以刺激Atrolnc-1与ABIN-1的相互作用。我们使用CRISPR/dCas9介导的协同激活介质转录激活系统产生了用于过表达ABIN-1的稳定C2C12细胞系。当这些转导的C2C12细胞用Atrolnc-1过表达时，与未转导的对照细胞也具有Atrolnc-1过表达的结果相比，NF-κB活性没有显著增加。这些结果表明ABIN-1过表达可以克服Atrolnc-1刺激的NF-κB活化。伴随这些变化，尽管Atrolnc-1上调，但MuRF-1表达也被ABIN-1过表达抑制。基于这些观察，我们提出Atrolnc-1阻碍ABIN-1的抑制能力，导致增强的NF-κB活性和MuRF-1转录。

   我们首先验证了AAV1在骨骼肌中的转染效率。在TA肌肉中注射AAV1-GFP 14天后，我们检测到超过80％的肌纤维表达GFP。然后我们将AAV1-Atrolnc-1注射到正常C57BL/6小鼠的TA肌肉中，与注射对照AAV1的肌肉相比，Atrolnc-1 RNA显著增加。通过TA肌肉中的原位杂交证实Atrolnc-1的过表达。与注射对照AAV1-shRNA的肌纤维的结果相比，肌纤维中的Atrolnc-1过表达导致纤维横截面积（CSA）减少约25％。这一结果通过Atrolnc-1过表达的肌纤维中CSAs分布的向左移动得到证实。我们还检测到与注射AAV1-对照的肌肉的结果相比，MuRF-1表达增加。因此，即使在正常小鼠中，Atrolnc-1过表达也足以引起肌纤维萎缩，突出其在肌肉蛋白质代谢中的分解代谢作用。

   在患有CKD的小鼠中使用AAV1介导的基因敲低来测试抑制Atrolnc-1是否能减轻CKD小鼠的肌肉萎缩。在肾次全切除术后3周将AAV1-shAtrolnc-1注射到小鼠的TA肌肉中。然后将小鼠配对喂养3周，然后检查TA肌肉。与注射对照AAV1的CKD小鼠的结果相比，Atrolnc-1的RNA水平降低了多达76％。在CKD小鼠中，TA肌肉重量与胫骨长度的比值显著降低；相反，在用AAV1-shAtrolnc-1处理的CKD小鼠中，这种肌肉萎缩指数显著改善，表明尽管CKD，Atrolnc-1的抑制仍防止小鼠骨骼肌质量损失。这种改善通过肌纤维的CSA增加和TA肌肉中肌纤维尺寸分布的向右移动得到证实。伴随这些结果，具有Atrolnc-1敲低的CKD小鼠的TA肌肉中MuRF-1的表达显著降低。因此，抑制Atrolnc-1可防止CKD小鼠肌肉萎缩并抑制MuRF-1表达。

   我们目前的研究揭示了一种名为Atrolnc-1的lncRNA，并证明其与ABIN-1相互作用，促进NF-κB的激活并导致肌肉中MuRF-1转录输出的增加。抑制Atrolnc-1在萎缩肌肉中抑制MuRF-1表达并改善肌肉萎缩。我们的研究结果还为lncRNAs和NF-κB信号传导之间的重要调节串扰提供了进一步的证据，这些信号传导可能具有超出肌肉疾病发病机理的更广泛的相关性。

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