Self-Recognition of an Inducible Host lncRNA by RIG-I Feedback Restricts Innate Immune Response

通过RIG-I反馈诱导的宿主lncRNA的自我识别限制先天免疫反应

期刊：CELL；影响因子：31.398                           

发表单位：中国医学科学院                            

    自身RNA lnc-Lsm3b使用位于长茎结构的不完全配对链上的初级富含GA的序列和结构基序，结合RIG-1蛋白，从而有效地与非自身病毒RNA竞争，在先天反应的后期螯合大部分RIG-I单体，从而防止下游抗病毒信号传导过度活化并及时终止先天反应以避免宿主组织损伤。

先天RNA传感器RIG-I在识别“非自身”病毒RNA后，启动抗病毒I型干扰素（IFN）生成中起着至关重要的作用。在这里，我们鉴定了宿主衍生的，IFN诱导型长非编码RNA，lnc-Lsm3b，其可在RIG-I单体结合中与病毒RNA竞争，并且在先天反应的晚期使RIG-I先天功能失活。从机制上讲，lnc-Lsm3b的结合限制了RIG-I蛋白的构象转变并阻止了下游信号传导，从而终止了I型IFN的产生。多元结构基序和长茎结构是lnc-Lsm3b对RIG-I结合和抑制的关键特征。

    先天免疫系统可以通过模式识别受体（PRR）感知入侵的病原体，以启动有效的先天反应来消除病原体。作为用于识别RNA病毒的最广泛研究的PRR，视黄酸诱导基因-I（RIG-I）已被证明可识别细胞质中的病毒RNA，并通过产生I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子触发先天免疫反应。众所周知，PRR触发的I型IFN过量产生可能导致炎症性自身免疫疾病。此外，观察到作为干扰素刺激基因（ISG）之一的RIG-I可以通过I型IFN和其他先天性刺激和长期存在的因子显著上调。因此必须精确调整相对持久的RIG-1的功能。然而，RIG-I激活先天细胞因子诱导的机制有效终止仍然是未知的。

    为了鉴定潜在的RIG-I相关宿主lncRNA，我们使用抗Flag抗体在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系中进行UV交联和RNA免疫沉淀（UV-RIP）测定与RIG-I相互作用的lncRNA并构建一个由靶向这些lncRNA的小干扰RNA（siRNA）组成的文库。初步筛选表明，lncRNA NONMMUT057981可能参与RIG-I介导的抗病毒先天免疫反应。

    来自UV-RIP-seq的覆盖轨迹显示RIG-I结合的RNA覆盖部分NONMMUT057981序列（染色体6，NONCODE V4.0中的核苷酸91,516,046-91,517,771），包含Lsm3内含子和外显子的部分序列（图1B）。通过在VSV感染后在RAW264.7细胞中使用抗RIG-I抗体获得的RIP样品的长读PacBio SMRT测序验证了lncRNA序列（图1B）。有趣的是，通过5ʹ和3ʹ快速扩增cDNA末端和来自小鼠腹膜巨噬细胞的总RNA的PacBio长读序列（GSE106254），我们发现了来自Lsm3基因座的两个剪接转录物变体。变体1（称为lnc-Lsm3a）（染色体6，核苷酸91,516,035-91,517,771，总计1,737nt）含有外显子1，外显子2，内含子1和Lsm3基因的内含子2的片段。与lnc-Lsm3a相比，可以结合RIG-1的变体2（称为lnc-Lsm3b，总共768nt）缺乏内含子1。用Stellaris FISH探针观察到lnc-Lsm3b主要定位于细胞质。此外，qPCR显示lnc-Lsm3b的表达在RNA病毒感染或5ʹppp-双链RNA转染后以时间依赖性方式显著上调。

    qPCR证实si-lnc-Lsm3b显著降低了lnc-Lsm3b的表达，但没有改变Lsm3基因表达。敲除lnc-Lsm3b在用VSV或SeV感染而不是DNA病毒HSV-1感染时显著增加巨噬细胞中I型IFN和促炎细胞因子白细胞介素IL-6的产生。这些数据表明，内源性lnc-Lsm3b可能在诱导I型IFN和促炎细胞因子中作为RIG-I活化的有效负调节因子。

    此外，我们产生了lnc-Lsm3b缺陷型（lnc-Lsm3b^-/-）RAW264.7细胞。当病毒RNA感染细胞时，lnc -Lsm3b^-/-细胞比lnc-Lsm3b^+/+细胞产生更多的IFN-α和IFN-b，并且在病毒感染后12-20小时差异更明显。此外，lnc-Lsm3b可以抑制病毒诱导的IFN-b和核因子kB（NF-κB）启动子活性。相应地，在感染后12或24小时，lnc-Lsm3b^-/-细胞中VSV的复制比lnc-Lsm3b^+/+细胞中的复制更显著。我们进一步发现，VSV感染后16小时后lnc-Lsm3b^-/-细胞中IRF3（p-IRF3）和NF-kB信号传导（p-p65和p-IKKa/b）的磷酸化水平显著高于lnc-Lsm3b^+/+细胞。然而，lnc-Lsm3b对IRF3信号传导的抑制作用比抑制NF-kB信号传导更为显著。这些数据表明，lnc-Lsm3b在抗病毒应答后期有效抑制RIG-I触发的I型IFN产生，不像其他负调节因子在抗病毒应答早期抑制RIG-I触发的信号传导。

    我们通过尾静脉注射高剂量VSV感染lnc-Lsm3b^-/-小鼠，发现lnc-Lsm3b^-/-小鼠对VSV诱导的致死率的敏感性明显低于lnc-Lsm3b^+/+小鼠。当用中等剂量的VSV注射时，lnc-Lsm3b^-/-小鼠在感染后18小时或24小时血清中产生的I型IFN（IFN-α和IFN-b）显著高于lnc-Lsm3b^+/+小鼠。与较高IFN的更有效的抗病毒作用一致，lnc-Lsm3b^-/-小鼠的病毒负荷显著降低，因此，肺部炎症的严重程度显著降低。感染后，Ifn-a4和Ifn-b mRNA的水平在lnc-Lsm3b^-/-小鼠的组织中也显著高于lnc-Lsm3b^+/+小鼠。值得注意的是，感染后lnc-Lsm3b的表达以时间依赖性方式在lnc-Lsm3b^+/+小鼠中增加，这与VSV感染后18小时和20小时IFNs表达的减少趋势相反。

    我们首先确定了RIG-I与lnc-Lsm3b结合的区域。体外RNA pull-down测定显示lnc-Lsm3b与RIG-1的CTD和解旋酶结构域结合。然而，我们注意到分离的解旋酶结构域是去除CARD和CTD结构域的截短突变体（RIG-I 235-735），其保持在柔性开放构象和暴露的多部分RNA结合位点。当lnc-Lsm3b与RIG-I结合时，RIG-I处于自我抑制形式，并且解旋酶结构域中的部分RNA结合位点被CARD的相互作用隐藏。为了进一步研究lnc-Lsm3b是否具有以自动抑制形式结合解旋酶结构域的能力，我们在钳形-CTD接头中构建C-末端截短以去除CTD结构域（RIG-I 1-797，表示为deltaCTD），结果显示lnc-Lsm3b不能与deltaCTD相互作用，表明当RIG-I维持在无活性状态时，lnc-Lsm3b刚刚与CTD结合但不与解旋酶结构域结合。RIP测定还证实了lnc-Lsm3b与RIG-1的CTD的结合。然后我们测量了lnc-Lsm3b和dsRNA与RIG-1的竞争性结合，发现RIG-I与poly（I：C）的结合随着lnc-Lsm3b的量的增加而急剧下降。相反，lnc-Lsm3b与RIG-I的结合随着5ʹppp-dsRNA（图4F）或从VSV感染的HEK293T细胞中提取的病毒RNA的增加而微弱地降低，表明lnc-Lsm3b具有竞争性地抑制5ʹppp-dsRNA或病毒RNA与RIG-I结合。此外，还发现lnc-Lsm3b和5ʹppp-dsRNA以竞争性方式结合RIG-1的CTD。

    我们在iCLIP文库中分析了RIG-I的交联诱导的截短位点。结果显示RIG-1与lnc-Lsm3b强烈交联，其中多数聚类在长茎结构中，这通过RNA折叠预测。MEME算法在lnc-Lsm3b转录物的交联位点周围产生了富含GA的基序。相反，iCLIP文库的iCLIP cDNA截短周围没有统计学上显著的保守基序，表明其他RNA与RIG-I结合的模式与lnc-Lsm3b完全不同，因此，我们推测这些RNA可能在RIG-I功能中扮演其他角色。将lnc-Lsm3b的交联簇中的每个富含GA的序列折叠成具有小凸起的小片段dsRNA，这与RIG-I与源自病毒基因组的polyU / UC或富含AU的RNA的优选结合不同。为了测量不完全的碱基配对特征是否是富含GA的基序结合RIG-I必不可少的，我们用含有一个富含GA的基序的短RNA片段进行等温滴定量热法（ITC）（1,384-1,388 nt at lnc- Lsm3b折叠成典型的不完全碱基配对dsRNA（M1），具有5ʹ-UUUUU-突出端，用于避免通过dsRNA结构结合RIG-I。我们首先证明5ʹppp-dsRNA可以高亲和力与RIG-I结合，并且仅在ATP存在下以1：1的摩尔比形成复合物，与在ATP存在下dsRNA以相等摩尔比结合RIG-I的发现一致。引人注目的是，M1在没有ATP的情况下与RIG-I结合，在ATP存在下具有比dsRNA更高的亲和力，并且以1：1的摩尔比形成复合物。因此，我们得出结论，折叠成dsRNA区域内的小凸起的主要基序是足以以高亲和力结合RIG-1的最小元件。

    为了进一步探索lnc-Lsm3b抑制RIG-I活化的分子机制，我们在体外生物化学显示，分离的CARDs可被RIG-I的解旋酶结构域下拉，通过添加5ʹppp-dsRNA（与CARD竞争结合解旋酶结构域）消除CARDs-解旋酶相互作用。相反，lnc-Lsm3b在存在或不存在5ʹppp-dsRNA时稳定了CARD和解旋酶结构域的相互作用，这在HEK293T细胞中通过CARD与RIG-1的deltaCARD（解旋酶和CTD）的共免疫沉淀证实。然而，一旦解旋酶结构域中的保守界面残基Phe540被丙氨酸（F540A）或天冬氨酸（F540D）氨基酸取代，CARD与突变体deltaCARD的结合就会被破坏，lnc-Lsm3b不再影响这两个域之间的相互作用。因此观察到CARD在没有VSV感染的细胞中与deltaCARD共定位或在lnc-Lsm3b存在下与VSV感染共定位。这些结果共同显示lnc-Lsm3b稳定CARD和解旋酶结构域之间的分子内相互作用，在病毒感染时保持RIG-1蛋白的自身抑制构象。

    我们进一步研究了自身lnc-Lsm3b在识别非自身病毒RNA后对细胞中RIG-I下游信号传导的影响。lnc-Lsm3b的缺乏显著增加了响应VSV感染的RAW264.7细胞中RIG-1与TRIM25的相互作用。相应地，在lnc-Lsm3b^-/-细胞中拯救lnc-Lsm3b表达扰乱了相互作用。此外，L929细胞中lnc-Lsm3b的过表达扰乱了TRIM25介导的病毒感染后RIG-1的K63连接的泛素化。lnc-Lsm3b缺陷增强了暴露于VSV感染的RAW264.7细胞中RIG-1与MAVS的相互作用。与对RIG-I活化没有影响一致，lnc-Lsm3b-158和lnc-Lsm3b-435都不干扰RIG-I与MAVS的相互作用，这进一步证实了RIG-I活化的抑制需要lnc-Lsm3b的完整RNA第二结构。总之，这些数据证明自身lnc-Lsm3b是响应RNA病毒感染的RIG-1信号传导级联的负调节物。

    我们揭示了通过lncRNA-RIG-I相互作用的RNA自我识别模型，其抑制RIG-I活化并以反馈方式防止I型IFN的过量产生以维持免疫稳态。这些发现拓宽了我们对lncRNA通过改变蛋白质构象调节蛋白质活性的作用机制的理解，并提供了一种潜在的策略来靶向先天ISG的下游信号传导控制自身免疫性炎症性疾病。

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