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LncRNA FEZF1-AS1 promotes tumor proliferation and metastasis in colorectal cancer by regulating PKM2 signaling
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LncRNA FEZF1-AS1通过调节PKM2信号通路促进结直肠癌的肿瘤增殖和转移
期刊：CLIN CANCER RES；影响因子：10.199
发表单位：江南大学附属医院
导 读
FEZF1-AS1通过与丙酮酸激酶M2（PKM2）结合并增强STAT3信号传导和有氧糖酵解，来促进CRC肿瘤发生和进展。
摘 要
我们使用lncRNA微阵列鉴定了CRC中一系列差异表达的lncRNA，并揭示FEZF1-AS1是过表达最多的之一。在两个扩展的CRC实验中进一步验证证实了CRC中FEZF1-AS1的上调，并且显示FEZF1-AS1表达增加与较差的存活率相关。功能测定显示FEZF1-AS1促进CRC细胞增殖和转移。机制上，FEZF1-AS1可以结合并增加丙酮酸激酶2（PKM2）蛋白的稳定性，导致细胞质和核PKM2水平增加。增加的细胞质PKM2促进丙酮酸激酶活性和乳酸产生（有氧糖酵解），而FEZF1-AS1诱导的核PKM2上调进一步激活STAT3信号传导。此外，PKM2在CRC组织中上调并与FEZF1-AS1表达和患者存活相关。
研究背景
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，其发病率和死亡率在中国都在增加。虽然已报道几种lncRNA，例如UCA1，LINC00152和PVT1在CRC中异常表达并显示出调节CRC肿瘤发生和进展，但大多数lncRNA在CRC中的功能和机制仍然未知。例如，CCAL可通过激活Wnt /β-连环蛋白通路促进CRC进展。我们之前的研究表明，UCA1和LINC00152通过促进CRC的肿瘤生长和化疗耐药而发挥癌基因的作用。在本研究中，我们使用lncRNA表达微阵列鉴定了一系列在CRC组织中具有异常表达的lncRNA。在两个扩增的CRC群组中的后续验证证实FEZF1反义RNA 1（FEZF1-AS1）（先前命名为AK057037或LOC154860）在超过60％的CRC组织中上调并且与较差的存活相关。
结 果
1 FEZF1-AS1在CRC组织中上调并预测预后不良
2 FEZF1-AS1在体外和体内促进CRC生长和转移
在CRC细胞系中测量FEZF1-AS1的内源性表达，并且选择具有相对较高/较低FEZF1-AS1表达的HCT116/LoVo细胞用于随后的功能测定，因为它们具有相对高的细胞运动性和转染效率。CCK-8和集落形成测定证明FEZF1-AS1敲低显著抑制CRC细胞增殖和集落形成，而异位FEZF1-AS1表达促进细胞增殖和集落形成。此外，与对照细胞相比，沉默FEZF1-AS1表达减少了S期细胞数量并增加了细胞凋亡，而异位FEZF1-AS1表达促进了G1-S细胞周期进展并抑制了CRC凋亡水平。此外，沉默FEZF1-AS1抑制CRC致瘤性，而FEZF1-AS1过表达促进小鼠的致瘤性。总的来说，这些数据显示了FEZF1-AS1在CRC中的生长促进功能。
我们进一步探讨了FEZF1-AS1对CRC转移的影响。 Trans well测定显示FEZF1-AS1敲低抑制HCT116和LoVo细胞的迁移和侵袭，而FEZF1-AS1过表达显著促进其迁移和侵袭。此外，我们使用两个转移模型，肺转移小鼠模型和原位肝转移小鼠模型评估了FEZF1-AS1对体内转移的影响。这些结果显示FEZF1-AS1过表达显著促进CRC肺和肝转移。
3 FEZF1-AS1与PKM2相关
为了阐明FEZF1-AS1在CRC中的潜在分子机制，我们测量了FEZF1-AS1沉默的HCT116细胞中的基因表达谱。与对照细胞相比，分层聚类揭示FEZF1-AS1沉默的HCT116细胞中1,261个基因的表达显著改变（倍数变化> 1.5）。在改变的基因中，富集的基因（P <0.01）属于几种关键的信号转导通路，包括JAK-STAT和HIF-1通路，已被证实与肿瘤的发生和发展密切相关。选择这些通路中的几个关键基因使用qRT-PCR进一步验证，并且结果证实了表达谱分析。这些数据表明FEZF1-AS1在CRC肿瘤发生和发展中具有广泛的调节功能。为了进一步鉴定由FEZF1-AS1直接调控的靶标，我们使用RNA pull-down分析来下调FEZF1-AS1结合蛋白。将回收的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析，并选择几个额外的差异条带用于质谱分析。基于通过质谱分析预测的蛋白质的功能注释和由FEZF1-AS1调节的潜在通路发现PKM2，其可以通过充当蛋白激酶激活STAT3信号传导，被认为是FEZF1-AS1相关蛋白。Western印迹进一步证实了在RNA pull-down测定中使用回收的蛋白质将FEZF1-AS1与PKM2结合。用抗PKM2抗体进行的RIP测定也证明了PKM2和FEZF1-AS1之间的关联。总之，这些数据表明FEZF1-AS1与PKM2物理结合。
4 FEZF1-AS1增加PKM2蛋白的稳定性
为了确定FEZF1-AS1是否调节PKM2活性，我们首先通过如前所述的qRT-PCR研究了FEZF1-AS1的亚细胞定位。FEZF1-AS1定位于HCT116细胞的细胞质和细胞核，表明其在CRC中的复杂调节机制。考虑到这一点，我们测量了PKM2在FEZF1-AS1耗尽的或FEZF1-AS1过表达的CRC细胞中的表达和亚细胞定位。与其相应对照中的那些相比，在FEZF1-AS1耗尽的HCT116细胞或FEZF1-AS1过表达的LoVo细胞中未观察到PKM2的mRNA水平的显著变化。然而，在FEZF1-AS1沉默的HCT116细胞中，总PKM2和核PKM2水平均显著下降，而在FEZF1-AS1中过表达LoVo细胞则增加，表明FEZF1-AS1可以在转录后水平增加PKM2蛋白水平。此外，我们观察到抑制蛋白酶体活性阻止了si-FEZF1-AS1诱导的HCT116细胞中内源性PKM2下调，表明通过泛素-蛋白酶体通路的PKM2降解被FEZF1-AS1抑制。
5 FEZF1-AS1通过调节PKM2在CRC中发挥肿瘤促进功能
为了研究FEZF1-AS1是否通过调节PKM2在CRC中发挥肿瘤促进功能，我们首先检测了PKM2对FEZF1-AS1诱导的细胞增殖的影响，并观察到PKM2过表达可以模拟FEZF1-AS1的肿瘤促进作用，而PKM2敲低阻断了CRC细胞中FEZF1-AS1诱导的细胞生长。此外，PKM2敲低逆转了FEZF1-AS1过表达CRC细胞中增加的细胞迁移率，并且PKM2过表达部分恢复了FEZF1-AS1沉默的CRC细胞中降低的细胞迁移率。然后，我们使用FEZF1-AS1Δ600突变体和缺乏A2结构域的PKM2突变体（PKM2ΔA2）评估可能区域的功能重要性，这些区域解释了CRC细胞中FEZF1-AS1和PKM2之间的结合。FEZF1-AS1突变体不能恢复CRC细胞中PKM2敲低抑制的细胞生长，并且PKM2突变体不能挽救FEZF1-AS1耗尽的CRC细胞中的细胞生长，表明FEZF1-AS1的1,200-1,800区域和PKM2的A2区域对其致癌作用至关重要。总之，这些数据证明FEZF1-AS1至少部分地通过结合和促进PKM2活性在CRC中发挥肿瘤促进功能。
6 PKM2在CRC中上调并与FEZF1-AS1表达正相关
为了进一步确定CRC组织中FEZF1-AS1和PKM2之间的相关性，我们首先使用IHC评估了138对CRC和NCT样品中PKM2的蛋白质表达。IHC染色结果显示，与其配对的NCT相比，超过一半的CRC（55.1％，76/138）显示PKM2表达增加。CRC组织中的PKM2蛋白水平与FEZF1-AS1水平正相关（r = 0.382，P <0.001），证实了FEZF1-AS1在临床CRC组织中对PKM2的正调节。同时，在裸鼠的CRC异种移植物中也观察到FEZF1-AS1和PKM2水平之间的正相关。
7 FEZF1-AS1激活PKM2/STAT3通路
在过表达CRC细胞的FEZF1-AS1中，核PKM2显著增加，并且表达谱分析显示STAT3通路可能被FEZF1-AS1调节，表明FEZF1-AS1的肿瘤促进功能主要由PKM2的蛋白激酶活性介导。为了确定FEZF1-AS1是否可以通过调节核PKM2活性激活STAT3信号，我们使用荧光素酶测定评估了具有不同FEZF1-AS1和PKM2表达水平的CRC细胞中STAT3通路的状态。在过表达CRC细胞的FEZF1-AS1或PKM2中激活STAT3信号传导，并且沉默PKM2表达阻断了FEZF1-AS1诱导的STAT3激活。相反，FEZF1-AS1敲低抑制STAT3活化，其通过PKM2过表达拯救。Western印迹结果进一步显示异位FEZF1-AS1表达增加STAT3（Tyr705）的磷酸化，其被PKM2敲低阻断。相反，FEZF1-AS1敲低抑制STAT3磷酸化，其通过PKM2的过表达而挽救。与这些结果一致，STAT3通路的下游靶标（MCL1，BIRC5，CCND1，BCL2L1，CDH1，MMP2和MMP9）在FEZF1-AS1过表达的CRC细胞中也显著上调，并且它们的表达被PKM2敲低部分抑制。总之，这些数据证明FEZF1-AS1通过PKM2激活STAT3通路。
8 FEZF1-AS1通过PKM2促进有氧糖酵解
PKM2四聚体是细胞质中PKM2的活性形式，具有高丙酮酸激酶活性，这是有氧糖酵解的限速因子。细胞质PKM2也受FEZF1-AS1调节，表明FEZF1-AS1也可调节有氧糖酵解。为了证明这一点，我们分析了FEZF1-AS1是否影响PKM2的丙酮酸激酶活性。FEZF1-AS1过表达增加丙酮酸激酶活性和乳酸产生，其在CRC细胞中PKM2敲低显著受损。相比之下，FEZF1-AS1敲低抑制了CRC细胞中丙酮酸激酶活性和乳酸产生，其通过PKM2过表达拯救。FEZF1-AS1Δ600突变体未能像全长FEZF1-AS1那样增加丙酮酸激酶活性和乳酸产生。PKM2ΔA2突变体也不能介导FEZF1-AS1对丙酮酸激酶活性和乳酸产生的影响。总之，这些数据表明，除了其对PKM2蛋白激酶活性的主要调节作用外，FEZF1-AS1还可通过增加PKM2的丙酮酸激酶活性来促进有氧糖酵解。
讨 论
FEZF1-AS1通过调节PKM2 / STAT3信号传导和糖酵解来增加CRC细胞增殖和转移，提供了CRC中FEZF1-AS1 / PKM2网络的第一个证据。这些数据表明FEZF1-AS1 / PKM2信号传导可能是CRC治疗中有希望的治疗靶点。然而，应进一步研究以确定介导FEZF1-AS1和PKM2之间关联的精确位点，这是开发靶向FEZF1-AS1/PKM2信号传导的特异性抑制剂的关键。
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