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LncRNA FEZF1-AS1 promotes tumor proliferation and metastasis in colorectal cancer by regulating PKM2 signaling

文字:[大][中][小] 2018/10/24     浏览次数:    

LncRNA FEZF1-AS1 promotes tumor proliferation and metastasis in colorectal cancer by regulating PKM2 signaling

LncRNA FEZF1-AS1通过调节PKM2信号通路促进结直肠癌的肿瘤增殖和转移

期刊CLIN CANCER RES影响因子:10.199 

发表单位:江南大学附属医院

                     


导 读

    FEZF1-AS1通过与丙酮酸激酶M2PKM2)结合并增强STAT3信号传导和有氧糖酵解,来促进CRC肿瘤发生和进展。


摘 要

    我们使用lncRNA微阵列鉴定了CRC中一系列差异表达的lncRNA,并揭示FEZF1-AS1是过表达最多的之一。在两个扩展的CRC实验中进一步验证证实了CRCFEZF1-AS1的上调,并且显示FEZF1-AS1表达增加与较差的存活率相关。功能测定显示FEZF1-AS1促进CRC细胞增殖和转移。机制上,FEZF1-AS1可以结合并增加丙酮酸激酶2PKM2)蛋白的稳定性,导致细胞质和核PKM2水平增加。增加的细胞质PKM2促进丙酮酸激酶活性和乳酸产生(有氧糖酵解),而FEZF1-AS1诱导的核PKM2上调进一步激活STAT3信号传导。此外,PKM2CRC组织中上调并与FEZF1-AS1表达和患者存活相关。



研究背景

    结直肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症,其发病率和死亡率在中国都在增加。虽然已报道几种lncRNA,例如UCA1LINC00152PVT1CRC中异常表达并显示出调节CRC肿瘤发生和进展,但大多数lncRNACRC中的功能和机制仍然未知。例如,CCAL可通过激活Wnt /β-连环蛋白通路促进CRC进展。我们之前的研究表明,UCA1LINC00152通过促进CRC的肿瘤生长和化疗耐药而发挥癌基因的作用。在本研究中,我们使用lncRNA表达微阵列鉴定了一系列在CRC组织中具有异常表达的lncRNA。在两个扩增的CRC群组中的后续验证证实FEZF1反义RNA 1FEZF1-AS1)(先前命名为AK057037LOC154860)在超过60%的CRC组织中上调并且与较差的存活相关。



结 果


1   FEZF1-AS1CRC组织中上调并预测预后不良

    分析五个配对的CRCNCT中的LncRNA表达谱以筛选CRC中差异表达的lncRNA。在所分析的约33,000个人lncRNA中,496个表现出显著的差异表达,其中306个基因被上调,190个基因在CRC中与NCT相比下调(倍数变化> 2P <0.05)。在496个显著失调的基因中,无监督的层次聚类鉴定了可以将CRC与相应的NCT区分开的52lncRNA(图1A)。除了CAR Intergenic 10CAR10)、致癌的lncRNAAK057037(现在命名为FEZF1-AS1)是52 lncRNA中过表达最多的新型lncRNA。因此,我们专注于FEZF1-AS1进一步研究。CRC实验中进行表达验证证实了CRCFEZF1-AS1的上调。接下来,我们检查了扩展的CRC实验中的FEZF1-AS1表达,揭示了与邻近NCT相比,它在CRC组织中显著上调(P <0.01),并且62%(108个中的67个)CRC组织显示超过2个与相应的NCT相比,FEZF1-AS1的上调倍数增加(图1B)。统计分析显示,CRCFEZF1-AS1的表达与肿瘤分期呈正相关P = 0.021),FEZF1-AS1表达与其他参数之间无显著相关性存活分析显示高FEZF1-AS1表达与较差的总存活率(对数秩= 8.104P = 0.004,图1C和无病存活(对数秩= 5.467P = 0.019,图1D显著相关



2   FEZF1-AS1在体外和体内促进CRC生长和转移

    在CRC细胞系中测量FEZF1-AS1的内源性表达,并且选择具有相对较高/较低FEZF1-AS1表达的HCT116/LoVo细胞用于随后的功能测定,因为它们具有相对高的细胞运动性和转染效率。CCK-8和集落形成测定证明FEZF1-AS1敲低显著抑制CRC细胞增殖和集落形成,而异位FEZF1-AS1表达促进细胞增殖和集落形成。此外,与对照细胞相比,沉默FEZF1-AS1表达减少了S期细胞数量并增加了细胞凋亡,而异位FEZF1-AS1表达促进了G1-S细胞周期进展并抑制了CRC凋亡水平。此外,沉默FEZF1-AS1抑制CRC致瘤性,而FEZF1-AS1过表达促进小鼠的致瘤性。总的来说,这些数据显示了FEZF1-AS1CRC中的生长促进功能。

    我们进一步探讨了FEZF1-AS1CRC转移的影响。 Trans well测定显示FEZF1-AS1敲低抑制HCT116LoVo细胞的迁移和侵袭,而FEZF1-AS1过表达显著促进其迁移和侵袭。此外,我们使用两个转移模型,肺转移小鼠模型和原位肝转移小鼠模型评估了FEZF1-AS1对体内转移的影响。这些结果显示FEZF1-AS1过表达显著促进CRC肺和肝转移



3   FEZF1-AS1PKM2相关

    为了阐明FEZF1-AS1CRC中的潜在分子机制,我们测量了FEZF1-AS1沉默的HCT116细胞中的基因表达谱。与对照细胞相比,分层聚类揭示FEZF1-AS1沉默的HCT116细胞中1,261个基因的表达显著改变(倍数变化> 1.5)。在改变的基因中,富集的基因(P <0.01)属于几种关键的信号转导通路,包括JAK-STATHIF-1通路,已被证实与肿瘤的发生和发展密切相关。选择这些通路中的几个关键基因使用qRT-PCR进一步验证,并且结果证实了表达谱分析。这些数据表明FEZF1-AS1CRC肿瘤发生和发展中具有广泛的调节功能。为了进一步鉴定由FEZF1-AS1直接调控的靶标,我们使用RNA pull-down分析来下调FEZF1-AS1结合蛋白。将回收的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析,并选择几个额外的差异条带用于质谱分析。基于通过质谱分析预测的蛋白质的功能注释和由FEZF1-AS1调节的潜在通路发现PKM2,其可以通过充当蛋白激酶激活STAT3信号传导,被认为是FEZF1-AS1相关蛋白Western印迹进一步证实了在RNA pull-down测定中使用回收的蛋白质将FEZF1-AS1PKM2结合。用抗PKM2抗体进行的RIP测定也证明了PKM2FEZF1-AS1之间的关联。总之,这些数据表明FEZF1-AS1PKM2物理结合。



4   FEZF1-AS1增加PKM2蛋白的稳定性

    为了确定FEZF1-AS1是否调节PKM2活性,我们首先通过如前所述的qRT-PCR研究了FEZF1-AS1的亚细胞定位。FEZF1-AS1定位于HCT116细胞的细胞质和细胞核,表明其在CRC中的复杂调节机制。考虑到这一点,我们测量了PKM2FEZF1-AS1耗尽的或FEZF1-AS1过表达的CRC细胞中的表达和亚细胞定位。与其相应对照中的那些相比,在FEZF1-AS1耗尽的HCT116细胞或FEZF1-AS1过表达的LoVo细胞中未观察到PKM2mRNA水平的显著变化。然而,在FEZF1-AS1沉默的HCT116细胞中,总PKM2和核PKM2水平均显著下降,而在FEZF1-AS1中过表达LoVo细胞则增加,表明FEZF1-AS1可以在转录后水平增加PKM2蛋白水平。此外,我们观察到抑制蛋白酶体活性阻止了si-FEZF1-AS1诱导的HCT116细胞中内源性PKM2下调,表明通过泛素-蛋白酶体通路PKM2降解被FEZF1-AS1抑制



5   FEZF1-AS1通过调节PKM2CRC中发挥肿瘤促进功能

    为了研究FEZF1-AS1是否通过调节PKM2CRC中发挥肿瘤促进功能,我们首先检测了PKM2FEZF1-AS1诱导的细胞增殖的影响,并观察到PKM2过表达可以模拟FEZF1-AS1的肿瘤促进作用,而PKM2敲低阻断了CRC细胞中FEZF1-AS1诱导的细胞生长。此外,PKM2敲低逆转了FEZF1-AS1过表达CRC细胞中增加的细胞迁移率,并且PKM2过表达部分恢复了FEZF1-AS1沉默的CRC细胞中降低的细胞迁移率。然后,我们使用FEZF1-AS1Δ600突变体和缺乏A2结构域的PKM2突变体(PKM2ΔA2)评估可能区域的功能重要性,这些区域解释了CRC细胞中FEZF1-AS1PKM2之间的结合。FEZF1-AS1突变体不能恢复CRC细胞中PKM2敲低抑制的细胞生长,并且PKM2突变体不能挽救FEZF1-AS1耗尽的CRC细胞中的细胞生长,表明FEZF1-AS11,200-1,800区域和PKM2A2区域对其致癌作用至关重要。总之,这些数据证明FEZF1-AS1至少部分地通过结合和促进PKM2活性在CRC中发挥肿瘤促进功能



6   PKM2CRC中上调并与FEZF1-AS1表达正相关

    为了进一步确定CRC组织中FEZF1-AS1PKM2之间的相关性,我们首先使用IHC评估了138CRCNCT样品中PKM2的蛋白质表达。IHC染色结果显示,与其配对的NCT相比,超过一半的CRC55.1%,76/138)显示PKM2表达增加。CRC组织中的PKM2蛋白水平与FEZF1-AS1水平正相关(r = 0.382P <0.001),证实了FEZF1-AS1在临床CRC组织中对PKM2的正调节。同时,在裸鼠的CRC异种移植物中也观察到FEZF1-AS1PKM2水平之间的正相关。



7   FEZF1-AS1激活PKM2/STAT3通路

    在过表达CRC细胞的FEZF1-AS1中,核PKM2显著增加,并且表达谱分析显示STAT3通路可能被FEZF1-AS1调节,表明FEZF1-AS1的肿瘤促进功能主要由PKM2的蛋白激酶活性介导。为了确定FEZF1-AS1是否可以通过调节核PKM2活性激活STAT3信号,我们使用荧光素酶测定评估了具有不同FEZF1-AS1PKM2表达水平的CRC细胞中STAT3通路的状态。在过表达CRC细胞的FEZF1-AS1PKM2中激活STAT3信号传导,并且沉默PKM2表达阻断了FEZF1-AS1诱导的STAT3激活。相反,FEZF1-AS1敲低抑制STAT3活化,其通过PKM2过表达拯救Western印迹结果进一步显示异位FEZF1-AS1表达增加STAT3Tyr705)的磷酸化,其被PKM2敲低阻断。相反,FEZF1-AS1敲低抑制STAT3磷酸化,其通过PKM2的过表达而挽救。与这些结果一致,STAT3通路的下游靶标(MCL1BIRC5CCND1BCL2L1CDH1MMP2MMP9)在FEZF1-AS1过表达的CRC细胞中也显著上调,并且它们的表达被PKM2敲低部分抑制。总之,这些数据证明FEZF1-AS1通过PKM2激活STAT3通路。



8   FEZF1-AS1通过PKM2促进有氧糖酵解

    PKM2四聚体是细胞质中PKM2的活性形式,具有高丙酮酸激酶活性,这是有氧糖酵解的限速因子。细胞质PKM2也受FEZF1-AS1调节,表明FEZF1-AS1也可调节有氧糖酵解。为了证明这一点,我们分析了FEZF1-AS1是否影响PKM2的丙酮酸激酶活性。FEZF1-AS1过表达增加丙酮酸激酶活性和乳酸产生,其在CRC细胞中PKM2敲低显著受损。相比之下,FEZF1-AS1敲低抑制了CRC细胞中丙酮酸激酶活性和乳酸产生,其通过PKM2过表达拯救FEZF1-AS1Δ600突变体未能像全长FEZF1-AS1那样增加丙酮酸激酶活性和乳酸产生。PKM2ΔA2突变体也不能介导FEZF1-AS1对丙酮酸激酶活性和乳酸产生的影响。总之,这些数据表明,除了其对PKM2蛋白激酶活性的主要调节作用外,FEZF1-AS1还可通过增加PKM2的丙酮酸激酶活性来促进有氧糖酵解。



讨 论

    FEZF1-AS1通过调节PKM2 / STAT3信号传导和糖酵解来增加CRC细胞增殖和转移,提供了CRCFEZF1-AS1 / PKM2网络的第一个证据。这些数据表明FEZF1-AS1 / PKM2信号传导可能是CRC治疗中有希望的治疗靶点。然而,应进一步研究以确定介导FEZF1-AS1PKM2之间关联的精确位点,这是开发靶向FEZF1-AS1/PKM2信号传导的特异性抑制剂的关键。


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