Transcriptional regulation of macrophage cholesterol efflux and atherogenesis by a long noncoding RNA

Transcriptional regulation of macrophage cholesterol efflux and atherogenesis by a long noncoding RNA

通过长链非编码RNA转录调节巨噬细胞胆固醇流出和动脉粥样硬化形成

期刊：Nature Medicine ；影响因子：32.621  

发表单位：加利福尼亚大学  

    LncRNA在调节动脉粥样硬化中的作用，MeXis与转录共激活因子DDX17的启动子结合相互作用促进关键胆固醇外排基因Abca1的表达。

    核受体调节基因表达以响应环境因素，但控制核受体细胞类型特异性的分子事件仍然知之甚少。在这里，我们概述了非编码RNA在调节LXRs的细胞类型特异性作用中的作用。我们将lncRNA MeXis鉴定为关键胆固醇外排基因Abca1的LXR依赖性转录的放大器。缺乏MeXis基因的小鼠以组织选择性方式显示减少的Abca1表达。此外，小鼠骨髓细胞中MeXis的缺失改变了Abca1基因座的染色体结构，损害了细胞对胆固醇的反应，并加速了动脉粥样硬化的发展。机理研究表明，MeXis与转录共激活因子DDX17的启动子结合相互作用并引导其结合。

    巨噬细胞在动脉壁内积聚过量胆固醇是动脉粥样硬化发病机制中的关键步骤。因此，巨噬细胞响应环境因素和脂质过量而整合代谢和免疫信号传导的能力是疾病易感性的重要决定因素。LXR是配体依赖性转录因子，其调节参与巨噬细胞对胆固醇反应的基因的表达，并且还调节炎症信号传导。LXR的激活通过诱导包括Abca1的基因干细胞促进反向胆固醇转运，Abca1编码质膜转运蛋白ABCA1。这种ATP依赖性转运蛋白对于HDL的产生至关重要，其功能在Tangier病中受损，这是一种以HDL缺乏和加速动脉粥样硬化为特征的综合征。

    LXR以特定情境的方式影响与脂质代谢相关的大量基因的表达。我们注意到，与其他细胞类型如肝细胞和脂肪细胞相比，编码关键胆固醇外排介质ABCA1的基因在巨噬细胞中被LXR更高水平的诱导（补充图1a）。为了深入了解这种细胞类型选择性LXR反应的基础，我们对用或不用LXR激动剂GW3965处理的小鼠腹膜巨噬细胞进行了全基因组转录分析。正如预期的那样，LXR激动剂治疗强烈诱导了经典蛋白质编码LXR靶基因的表达（补充图1b）。与LXR在代谢中确定的作用一致，GW3965诱导基因的本体术语网络显示出对脂质调节过程和巨噬细胞特异性通路的强烈富集（补充图1c）。有趣的是，我们还观察到LXR活化诱导了有限数量的lncRNA（补充图1d）。这些lncRNA中的一些位于蛋白质编码基因的邻近基因组区域中，在介导LXR对代谢的作用中具有确定的作用。与这些lncRNA最接近的蛋白质编码基因的基因本体分析显示胆固醇代谢过程的富集，这与这些非编码RNA的子集可调节相邻蛋白质编码基因的活性的想法一致。（注意：作者通过RNAseq验证LXR激动剂诱导LXR靶基因的表达，并找到差异表达的lncRNA）。

    通过LXR ChIP-seq研究也显示LXR与其基因调节区域结合的证据的最强烈诱导的命中之一是预测的转录物，注释为AI427809。我们将该转录物命名为MeXis（巨噬细胞表达的LXR诱导的序列）（注意：ChIP-seq结合启动子寻找临近lncRNA，用于研究）。值得注意的是，MeXis基因位于已建立的LXR靶基因Abca1和LeXis附近。RNA拷贝数分析显示MeXis在小鼠巨噬细胞中高表达，实时PCR分析显示，LXR（GW3965）和RXR（LG268）激动剂在原代巨噬细胞中以LXR依赖性方式诱导MeXis和Abca1表达。

    我们鉴定了MeXis启动子区域内的LXR反应元件（LXRE），其在ChIP-seq分析中被LXR结合。

    区分蛋白质编码和非编码RNA的计算分数预测了MeXis转录本的低编码潜力。小鼠骨髓衍生的巨噬细胞中的单分子RNA FISH证实了MeXis的核定位。MeXis主要位于富含染色质的不溶性核沉淀中。即使在高水平外源表达时，MeXis主要是核。这种定位强烈表明MeXis最有可能充当核RNA，而不是在细胞质中被翻译成短蛋白。

    由于已经显示一些lncRNA调节相邻基因的表达（注意：lncRNA的cis调控机制），我们假设MeXis的丧失可能影响Abca1的表达。为了支持这一想法，siRNA介导的小鼠腹腔巨噬细胞中MeXis或RXRα/β的敲低降低了Abca1转录水平。靶向MeXis的反义寡核苷酸（ASO）也降低Abca1水平。相反，巨噬细胞中MeXis的稳定过表达增强了ApoA-I受体的Abca1表达和胆固醇外流能力。

    为了更好地破译MeXis对巨噬细胞代谢的贡献，我们产生了MeXis敲除小鼠。与我们的siRNA研究一致，MeXis-/-腹膜巨噬细胞显示Abca1转录水平降低。值得注意的是，在西方饮食喂养的小鼠中，与WT小鼠相比，在MeXis-/-组织中Abca1 mRNA表达差异地改变。我们还证实，与WT巨噬细胞相比，MeXis中的Abca1蛋白水平降低。这些结果表明MeXis以特定于上下文的方式增强Abca1表达。

    我们观察到响应MeXis过表达，敲低或敲除的其他LXR靶基因变化，表明MeXis不等同地调节所有LXR靶基因。WT和MeXis-/-原代腹膜巨噬细胞的无偏倚转录组学分析显示脂质代谢通路和炎症信号传导的富集与MeXis-/-巨噬细胞中Abca1表达的改变一致，我们观察到与来自WT小鼠的MeXis-/-的腹膜巨噬细胞中ApoA-I依赖性外排能力的降低。总之，这些结果表明，在面对巨噬细胞胆固醇负荷时，MeXis是最大Abca1表达所必需的。

    为了进一步探索MeXis作为RNA的能力并确认其在体内调节Abca1表达的能力，我们使用腺病毒载体在小鼠肝脏中表达MeXis。值得注意的是，我们观察到血清胆固醇水平的增加-肝脏ABCA1表达增强的标志性特征-在肝脏中异位表达MeXis的小鼠中。我们还证实了MeXis在肝脏中的表达诱导Abca1 mRNA而不影响其他LXR靶基因的表达。MeXis表达相应地增加ABCA1蛋白水平。

    eRNA表达可以作为增强子位点活性和转录激活的替代标志物。先前已经定义了巨噬细胞中Abca1周围的增强子元件。有趣的是，与WT细胞相比，MeXis-/-巨噬细胞显示响应于LXR活化的Abca1增强子的eRNA表达降低。为了评估MeXis是否可以影响反式Abca1基因的转录，我们用杂合的MeXis-/+小鼠杂交Abca1Flox/Flox小鼠。这种策略使我们能够特异性地测量MeXis缺陷对转化为突变MeXis等位基因的Abca1转录物的影响。我们发现MeXis表达的减少降低了反式Abca1的表达。

    这些观察结果使我们假设MeXis可能影响Abca1基因座的染色质动力学，从而调节其转录。与此观点一致，在腹膜巨噬细胞上进行的ATAC-seq在MeXis缺陷的情况下显示在Abca1基因座内的多个位点处的钝化可及性。对Abca1启动子附近可及位点的定量显示MeXis-/-巨噬细胞的可及性降低。相比之下，我们发现Tlr4基因座的可及性没有差异，表明MeXis缺陷对某些染色质区域的选择性。

    为了进一步研究MeXis作用的机制，我们使用无偏的lncRNA：染色质亲和捕获技术从巨噬细胞提取物中提取MeXis并鉴定相互作用的蛋白质（注意：RNA pull down寻找其直接结合的蛋白）。通过质谱分析MeXis相互作用鉴定出DDX17，一种已建立的核受体辅激活因子，作为潜在的相互作用配偶。我们证实了MeXis和DDX17在小鼠巨噬细胞的RNA免疫沉淀研究中的强烈相互作用，无论是否使用交联剂。DDX17作为转录共激活因子的先前表征使我们假设DDX17可以在Abca1基因座处起作用。根据这一想法，ChIP-PCR分析显示DDX17在巨噬细胞中Abca1增强子区域的LXR结合位点富集。此外，由于MeXis缺失，DDX17结合显著降低。有趣的是，LXR结合的模式也由于MeXis的丧失而改变，Abca1启动子的占据减少，但在内含子位点的结合增强。这些结果表明MeXis促进DDX17的共激活因子作用以增强LXR介导的Abca1表达。为了明确确定MeXis是否被募集到Abca1基因座，我们使用ChIRP-qPCR技术，发现MeXis在Abca1的许多位点结合，显示MeXis-/-和WT巨噬细胞之间的差异可及性。

    为了进一步确定DDX17在Abca1调节中的重要性，我们利用CRISPR-Cas编辑产生了DDX17缺陷的永生化骨髓衍生的巨噬细胞。使用两种不同的切除策略删除DDX17降低了基线时的Abca1水平并响应LXR激活。这些结果强烈表明DDX17是巨噬细胞中Abca1表达所必需的（注意：敲低lnc的结合蛋白查看是否影响潜在靶基因Abca1的表达）。为了分析DDX17和MeXis之间的上位关系，我们使用CRISPR-Cas生成DDX17/MeXis双敲除巨噬细胞。与DDX17单敲除相比，在DDX17缺陷的情况下缺失MeXis未能进一步降低Abca1转录物或蛋白质水平。总之，这些结果证明DDX17有助于依赖于Mexis的Abca1调节。

    该研究还揭示了lncRNA在心血管疾病中的意外作用。通过LXR通路控制巨噬细胞基因表达与动脉粥样硬化的发病机理有因果关系。MeXis的鉴定填补了我们对控制细胞对胆固醇超负荷和动脉粥样硬化的反应的通路的理解中的空白。很有可能推测靶向LXR-MeXis-Abca1轴可以增强巨噬细胞逆向胆固醇转运以治疗或预防动脉粥样硬化疾病，同时绕过不希望的LXR激活在其他组织中的副作用。

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