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Human Pancreatic β Cell lncRNAs Control Cell-Specific Regulatory Networks
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人胰腺β细胞lncRNAs控制细胞特异性调节网络
期刊：Cell Metabolism；影响因子：20.565
发表单位：伦敦帝国理工学院
导 读
胰腺β细胞中lnc是如何发挥作用的？作者发现敲低lncRNA与敲低转录因子对基因表达的影响类似，提示lncRNA在调控中的重要作用。依据lnc顺式调控机制，在重要转录因子PDX1附近，找到lncRNA PLUTO，发现该lnc调控PDX1的表达。
最近的研究发现人类胰腺β细胞中有数千个lncRNA。β细胞lncRNA通常是细胞类型特异性的并且在分化期间表现出动态调节。尽管这些特征暗示了lncRNA在β细胞基因调控和糖尿病中的作用，但β细胞lncRNA的功能仍然很大程度上未知。在这项研究中，我们使用转录物敲低和共表达网络分析研究了β细胞特异性lncRNA和转录因子的功能。这揭示了与转录因子协同作用以调节β细胞特异性转录网络的lncRNA。我们进一步证明lncRNA PLUTO影响局部3D染色质结构和PDX1的转录。这些结果暗示lncRNA参与β细胞特异性转录因子网络的调节。
研究背景
转录组调查揭示了数万种具有低蛋白质编码潜力的超过200个核苷酸的哺乳动物转录物。这些长链非编码RNA中的一小部分已被证明通过调节染色体结构，转录，剪接，mRNA转运，稳定性或翻译来控制基因表达。因此，特定的lncRNA涉及各种关键过程，包括随机X染色体失活，印记，细胞周期，器官发生，分化，多能性和癌症进展。尽管具有广泛的生物学作用，但真正具有功能的lncRNA的比例以及lncRNA在人类生物学和疾病中的真实影响仍然知之甚少。
结 果
1
人β细胞lncRNA敲低导致深刻的转录表型
为了直接测试胰腺β细胞lncRNA的调节功能，我们在葡萄糖响应性人胰岛β细胞系EndoC-βH1中进行了功能丧失实验。我们选择了人类模型，因为只有一些人类lncRNA是进化保守的，我们扰乱了lncRNA的功能通过基于RNAi的转录物敲低。
选择用于敲低的lncRNA来源于25个lncRNA，其显示在人胰岛中显著富集的表达。在这25个lncRNA中，有12个入围，因为它们附近位置有重要功能的蛋白质编码基因。然后，我们针对12种设计amiRNA序列。还获得了五种必需的胰岛TF（HNF1A，GLIS3，MAFB，NKX2.2和PDX1）的有效的amiRNA。（注意：作者找了一组候选lnc，依据临近位置有重要编码基因，挑选了12个lnc，而后设计敲低的siRNA）。
正如预期的那样，胰岛TF的敲低始终产生转录表型。值得注意的是，12个胰岛lncRNA中的9个的敲低也引起转录变化。更详细的分析显示，一些呈现敲低表型的lncRNA对邻近基因具有明显的作用，表明可能的顺式调节机制，尽管其他此类lncRNA似乎不影响邻近基因，因此可能通过反式调节机制发挥作用。（注意：12个敲低的lnc中有9个引起变化）。
2
人胰岛lncRNAs和TFs调节共同的基因表达程序
为了深入了解由胰岛特异性lncRNA和TF调控的表达程序，我们比较了它们的敲低基因表达表型。我们首先评估了在敲低不同胰岛TF后发生的基因表达的变化，并且发现所有成对比较的高Pearson相关值。该发现与胰岛特异性TF通常与常见基因组靶标结合并以组合方式起作用的概念一致。有趣的是，在抑制几种lncRNA后发生的转录变化与抑制TF后观察到的转录变化显著相关。因此，这些基因敲低实验的结果表明，选择的胰岛特异性lncRNA和TF可以调节共同的基因表达程序。（注意：作者敲低lnc，与TF，查看二者引起的基因变化是否相关）。
3
胰岛TF和lncRNA共同调节与增强子簇相关的基因
最近的研究表明，胰岛TF通过靶向增强子簇来调节细胞特异性转录。鉴于胰岛lncRNAs和TFs的敲低表明它们调节相似的基因，我们研究胰岛lncRNAs是否也调节增强子簇相关基因。正如预期的那样，基因集富集分析（GSEA）显示，具有胰岛富集表达的基因，与增强子簇相关的基因，或与多个TF结合的增强子相关的基因在敲低所有五种TF后被下调，而在相似水平表达的10个基因对照组中没有观察到这种情况。同样地，与HI-LNC12,15,30,78,80,85和71敲低后下调的基因中富集与增强子簇相关的基因和显示胰岛特异性表达的基因。因此，这些结果表明胰岛特异性TF和lncRNA通常共调节与增强子簇相关的基因。
4
β细胞lncRNA和TF形成胰岛特异性共表达网络的一部分
我们接下来使用独立的实验方法来验证人β细胞lncRNA和TF调节共同基因表达程序的观察结果。我们使用来自64个人胰岛样品的RNA测序（RNA-seq）谱的加权基因共表达分析（WGCNA）实施该分析。这确定了包含超过100个基因的25个主要基因模块，命名为M1-M25，其在人胰岛样品中显示出高度显著的共表达（图5A）。我们接下来确定哪些共表达模块包含胰岛lncRNA。不是使用我们先前定义的lncRNA组，而是使用一组2,373个β细胞lncRNA进行该分析，所述2,373个β细胞lncRNA使用从41个胰岛样品汇集的约50亿个链RNA-seq读数进行新注释。发现β细胞lncRNA富集在七个胰岛共表达模块（M3，M7，M12，M13，M18，M20和M21）中（图5B）。
我们接下来描述了这七种富含lncRNA的共表达模块的性质。其中五个（M3，M7，M12，M18和M20）富含与胰岛增强子簇相关的基因（图5A-5C，标记为蓝色）。另外两个模块（M13和M21）被富集用于mRNA翻译和代谢通路中的普遍表达的基因。在富含lncRNA和增强子簇的模块中，三个（M3，M7和M18）也富含胰岛特异性TF基因（图5D），这些模块中的两个（M3和M7）包含12个lncRNA中的9个，这些lncRNA在EndoC-βH1细胞中被敲低。模块M3是七种富含lncRNA的模块中最大的模块，其特征在于与原型胰岛细胞功能相关的基因本体论（GO），并含有几个胰岛TF和lncRNA（图5E）。与这些发现一致，我们发现许多胰岛lncRNA和已知细胞特异性TF的实例显示了人胰岛样品中基因表达水平的紧密相关性（图5F;图S5C）。因此，这些发现表明β细胞特异性lncRNA，TF和与胰岛增强子簇相关的基因构成了共同表达程序的一部分。（注意：使用WGCNA依据相关性将转录因子与lncRNA关联起来）。
5
PLUTO调节PDX1，一种必需的转录调节因子
为了探索β细胞lncRNA如何调节细胞特异性转录网络，我们专注于HI-LNC71，一种核富集的转录物，其从位于PDX1上游约3kb的启动子转录，以反义方向。PDX1是胰腺发育和β细胞功能的必需转录调节因子（注意：找一个重要的转录因子作为靶标）。基于该基因组位置，我们将HI-LNC71重命名为PDX1基因座上游转录物PLUTO。
PLUTO的潜在重要性通过以下观察得到加强：PLUTO是来自T2D或IGT供体的胰岛中最显著下调的lncRNA之一）。有趣的是，PDX1在来自T2D和IGT的供体的胰岛中也被下调。
PLUTO是一种多同种型转录物，其包含跨越接近100kb的五个主要外显子，包括一群增强子，其与人胰岛和EndoC-βH1细胞中的PDX1启动子进行3D接触。该观察结果表明PLUTO可能影响PDX1基因的顺式调节。
为了测试PLUTO是否调节PDX1，我们首先在amiRNA介导的PLUTORNA敲低后检查EndoC-βH1细胞，发现PDX1 mRNA和蛋白质水平降低。类似地，分散的原代人胰岛细胞中PLUTORNA的敲低引起PDX1 mRNA的减少。为了通过互补方法验证这些实验，我们使用CRISPR干扰（CRISPRi），其涉及靶向基因转录起始位点下游的指导RNA（gRNA）以阻断其转录。靶向PLUTO起始位点下游区域的两个独立的gRNA相对于非靶向gRNA有效地降低了PLUTO RNA水平，并且在两种情况下，这导致PDX1 mRNA表达降低（图6E）。因此，扰乱PLUTO RNA水平或其转录导致对PDX1 mRNA的相同抑制作用。（注意：敲低过表达，说明lnc与靶基因表达量变化相关）。
6
PLUTO调节PDX1转录和局部3D染色质结构
为了评估PLUTO功能的潜在机制，我们首先检查了PLUTO是否控制PDX1的稳定性或转录。使用放线菌素D的转录抑制实验显示在PLUTO敲低后PDX1mRNA的稳定性没有显著差异。相反，在PLUTO敲低后内含子PDX1RNA减少，表明PLUTO调节PDX1转录。
因为PLUTO跨越增强子簇，我们假设它可以调节活性增强子的染色质状态。因此，我们敲低了β细胞中的PLUTO并测量了簇内几种增强子的H3K27乙酰化以及H3K4单甲基化和三甲基化水平。我们的结果表明这些特征性活性染色质标记没有显著变化。
我们接下来确定PLUTO是否影响增强子簇和PDX1启动子之间的3D接触。使用定量染色质构象捕获（3C）测定检查PDX1基因座揭示两个远上游增强子在PLUTO敲低后显示与PDX1启动子的接触减少。因此，这些发现表明PLUTO调节PDX1的转录，并且这与其促进PDX1启动子与其增强子簇之间的接触的能力相关（图7E）。
讨 论
在目前的研究中，我们已经检验了lncRNAs在胰腺β细胞中的细胞特异性基因调控中发挥作用的假设，胰腺β细胞是人类糖尿病发病机制中的核心细胞类型。因此，我们首次对一组人β细胞特异性lncRNA的功能进行了系统分析。我们的实验揭示了β细胞lncRNA的几个例子，其中序列特异性扰动引起转录和功能表型。我们进一步显示β细胞特异性lncRNA和TF调节共同的转录网络。最后，我们已经证明β细胞特异性lncRNA直接或间接参与人增强子簇的调节，这是胰岛特异性转录因子的主要功能靶点和胰岛细胞转录程序的关键顺式调节决定因子。
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