The Long Noncoding RNA CAREL Controls Cardiac Regeneration

The Long Noncoding RNA CAREL Controls Cardiac Regeneration

长非编码RNA CAREL控制心脏再生

期刊：J Am Coll Cardiol；影响因子：16.834    

发表单位：哈尔滨医科大学                              

         心脏再生过程中是否有lnc参与呢？本研究通过对发育中心脏做lnc表达谱筛选到lnc CAREL在新生小鼠的心肌细胞中显著上调，机制研究发现该lnc通过ceRNA调控心脏再生。

         背景：由于心肌细胞有丝分裂的丧失，成年哺乳动物心脏在缺血性损伤后失去再生能力。然而，心肌细胞的有丝分裂后性质的分子机制仍然很大程度上未知。

         目标：本研究的目的是确定lncRNAs在出生后和成人损伤期间心脏再生中的重要作用。

         结果：发现lncRNA CAREL在新生小鼠的心肌细胞中显著上调，抑制再生能力。CAREL作为竞争性内源性核糖核酸，结合miR-296抑制Trp53inp1和Itm2a（miR-296的靶基因）的表达。

         心肌梗死（MI）仍然是全世界人类死亡的主要原因，心脏功能受损和心力衰竭部分是由于心肌细胞丢失造成的。虽然干细胞移植已被提议作为一种治疗方法来取代损伤后的凋亡心肌细胞，有效保留和分化宿主心肌中移植的干细胞仍然是一项重大挑战。lncRNA是长度超过200个核苷酸的一组核糖核酸，其通过转录或转录后的不同分子机制调节基因和/或基因产物/蛋白质的功能和水平。lncRNA参与多种生物过程，例如细胞增殖，细胞凋亡，基因组印记，细胞命运测定，RNA替代剪接和染色质修饰。

         首先进行微阵列分析以鉴定出生后第1天（P1）至第7天（P7）的小鼠心脏中异常调节的lncRNA。发现总共128个异常调节的lncRNA。然后进行qPCR以确定P7上8个lncRNA的显著上调（> 5倍）。这8个lncRNA中的一个是748个核苷酸的转录物，其含有在心肌细胞的细胞质中表达的3个片段为方便起见，我们将这种lncRNA命名为“心脏再生相关的lncRNA”（CAREL）。来自P1，P3，P7和P10的出生后心脏以及在P1，P3和P7的出生后心脏中分离的左心室肌细胞中CAREL水平逐渐增加。生物信息学分析排除了CAREL基因编码序列中主要开放阅读框的存在。（注意：作者对小鼠芯片做芯片筛选差异表达的lncRNA，寻找与心脏发育相关的lncRNA）。

         使用Myh6驱动的心肌细胞特异性CAREL转基因（TG）小鼠探索CAREL上调在出生后心脏    发育和再生中的功能作用。正如所料，与野生型（WT）对照同窝小鼠相比，CAREL TG小鼠心脏中CAREL丰度显著增加。然而，心肌细胞的增殖能力明显降低，但CAREL TG小鼠的心肌细胞大小明显增大。有趣的是，在P1处进行顶端切除后的P21，心脏CAREL过表达导致TG小鼠心肌瘢痕增加，心肌细胞增殖受抑制，并且相对于WT小鼠中的心肌细胞面积增大。结果表明，新生儿心脏中CAREL的心脏过度表达足以导致心脏再生能力的丧失。此外，P1新生小鼠心肌细胞中的CAREL过表达显示出增殖能力的显著降低。（注意：小鼠lnc过表达证明其对心脏再生的抑制）。

         研究了CAREL敲低对MI期间心肌细胞复制和心脏再生的影响。通过心肌内施用腺病毒shRNA（Ad-shCAREL）成功沉默心脏中CAREL的表达。在心肌梗死后第14天，Ad-shCAREL诱导的PALL对CARI的缺乏显著降低了心肌瘢痕大小，改善了射血分数（EF）和缩短分数（FS），同时伴随着有丝分裂活性（pH3 +染色）和心肌细胞胞浆分裂的增加，横截面积减。这些数据表明CAREL缺陷促进了新生儿心脏受伤后的心脏再生。Ad-shCAREL显著减少了瘢痕大小，促进了心肌细胞的增殖，并增强了心脏梗塞后心肌的心脏再生。

    我们接下来探讨了沉默CAREL后心肌细胞是否可以重新进入细胞周期。如图3K所示，Ad-shCAREL在P7新生小鼠心肌细胞中腺病毒介导的CAREL沉默显著增加了增殖能力，正如DNA合成，心肌细胞有丝分裂和胞质分裂增加所表明的那样。数据表明，CAREL的敲低可以诱导缺血性心肌损伤的出生后小鼠心肌细胞分裂和心脏再生的再激活。（注意：小鼠lnc敲低证明其对心脏再生的促进）。

         最近的研究表明，lncRNA可以通过序列互补机制通过结合和吸收miRNA而充当海绵或竞争内源核糖核酸（ceRNA），从而影响靶miRNA的靶基因的表达。因此，我们建立了以下实验来破译CAREL作用的潜在miRNA机制。

         首先，我们的生物信息学分析预测CAREL结合的miRNA，包括miR-344，-135b，-705，-296和-760。这个结果促使我们测试CAREL是否可以作为这些miRNA的ceRNA。我们的体外功能研究表明，miR-296模拟物（ago-296）增加了心肌细胞增殖，但miR-344，-135b，-705和-760模拟物没有增加。其次，荧光素酶测定和生物素-抗生物素蛋白下拉测定证实miR-296可以与HEK293细胞以及新生儿心肌细胞中的CAREL相互作用。此外，通过其反义寡核苷酸（anta-296）消耗内源性miR-296显著抑制来自P1心脏的心肌细胞的增殖和有丝分裂。与有丝分裂减弱相一致，ago-296使双核心肌细胞的数量也明显减少；相反，它在用anta-296转染的心肌细胞中增加。这些结果表明miR-296促进了心肌细胞的增殖。（生信预测潜在miR，对潜在miR过表达，看其是否可以对心肌细胞增殖有影响，找到miR-296，而后pull-down，萤光素酶实验证实lnc-CAREL与miR-296直接相互作用）。

         此外，沉默CAREL增加了心肌细胞的增殖，并且anta-296消除了这种有利的作用。相反，miR-296与ago-296过表达消除了由新生儿心室肌细胞中CAREL的强制表达诱导的心肌细胞复制的减少。结果表明miR-296介导CAREL在出生后心肌细胞增殖和心脏再生中的调节作用。（注意：lnc-CAREL，miR-296彼此过表达敲低，证明二者在功能上符合ceRNA相关性）。

         为了进一步了解介导CAREL和miR-296作用的信号分子，我们进行了以下分析。我们首先使用Targetscan和miRDB数据库进行理论分析，以确定miR-296的潜在靶基因。（注意：软件预测miR的靶基因）。通过这种方式，我们将Trp53inp1，Itm2a，Cep97和Gas7鉴定为候选基因，其在3'非翻译区（3'UTR）中具有用于miR-296结合的种子位点。我们接下来通过以下步骤实验性地建立Trp53inp1和Itm2a作为miR-296的靶基因。首先，miR-296的过表达降低了P1新生心肌细胞中Trp53inp1和Itm2a的蛋白质水平，但没有降低Gas7和Cep97的蛋白质水平。相反，miR-296的沉默上调Trp53inp1和Itm2a蛋白水平，但不影响Gas7和Cep97的表达（注意：判断候选靶基因的表达是否随miR-296的变化而变化，从相关性上判断是否是靶基因）。此外，心肌细胞的细胞周期活性被Trp53inp1或Itm2a抑制，但不被Gas7和Cep97抑制。此外，荧光素酶测定显示miR-296减少了携带Trp53inp1或Itm2a的3'UTR的载体引发的荧光素酶活性（图8G）。这些数据表明Trp53inp1和Itm2a是CAREL-miR-296轴的下游靶基因。（注意：荧光素酶实验证明miR与靶基因UTR取结合）。

         lncRNA CAREL由3个片段产生，我们命名为A，B和C。为了详细说明这些片段参与调节心肌细胞增殖和心脏再生，我们分析了每个片段对CAREL诱导的心肌细胞周期停滞的贡献。我们发现片段C的强制表达，而不是片段A和B的强制表达，这导致心肌细胞增殖的抑制。更引人注目的是，miR-296在CAREL上的结合位点在小鼠和人之间是保守的，并且恰好落在片段C内。（注意：研究lncRNA的哪个外显子在发挥作用，找到保守的区段）。

         长期以来人们一直认为，成年哺乳动物心脏失去了再生受损心肌的能力，并且通常会在受损后形成持续的纤维性瘢痕并发展为收缩性心力衰竭。然而，这一概念受到最近研究的挑战，这些研究表明，未成熟的哺乳动物心脏不是有丝分裂后器官，并且通过促进心肌细胞增殖维持了再生受损心脏的瞬时能力。目前的工作证实了这些发现，并揭示出生后CAREL的上调导致心肌细胞增殖能力和心脏再生的丧失。我们的结果进一步证明CAREL通过直接结合机制通过靶向Trp53inp1和Itm2a来调节心肌细胞有丝分裂，从而充当miR-296的ceRNA。

文献解读：食管癌lncRNA-TTN-AS1竞争性结合miR-133b上调Snail1的表达，促进EMT过程