Long noncoding RNA licensing of obesity-linked hepatic lipogenesis and NAFLD pathogenesis

Long noncoding RNA licensing of obesity-linked hepatic lipogenesis and NAFLD pathogenesis

长链非编码RNA诱导与肥胖相关的肝脂肪生成和NAFLD发病机制

期刊：NATURE COMMUNICATIONS；影响因子：12.353  

发表单位：密歇根大学 

    上期我们介绍“lncRNA与蛋白质结合促进其泛素化降解”lnc与蛋白质结合促进其泛素化降解，进而影响靶基因的机制。本研究发现lnc与EDF1和LXR蛋白质形成复合物，增强其转录活性，激活肝脂肪生成基因。同样从lnc与蛋白质结合的角度研究lncRNA的机制。

通过激活LXR-SREBP1c通路在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）中异常诱导肝脏脂肪生成。迄今为止，已经阐明了许多影响LXR和SREBP1c转录活性的蛋白质因子。然而，这种调节轴是否与长非编码RNA（lncRNA）相互作用仍然很大程度上未被探索。在这里，我们显示lncRNA Blnc1的肝脏表达在肥胖和小鼠的NAFLD中强烈升高。Blnc1是响应LXR活化诱导SREBP1c和肝脂肪生成基因所必需的。对Blnc1核糖核蛋白复合物的蛋白质组分分析鉴定出EDF1是LXR转录复合物的组分，其与Blnc1协同作用以激活脂肪生成基因程序。这些发现说明了lncRNA促进肝脂肪生成加剧胰岛素抵抗和NAFLD。

    非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是代谢综合征的普遍肝脏表现，其范围从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。NAFLD发病机制涉及几种致病机制，包括胰岛素抵抗，线粒体功能障碍，脂毒性和内毒素暴露。由于脂肪组织功能障碍导致脂质通量升高，这种从头脂质合成的增加加剧了胰岛素抵抗状态下的肝脂肪变性。肝X受体（LXR）和甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）是肝脏脂肪生成基因程序的中心调节因子。已揭示LXR-SREBP1c通路的关键蛋白质组分，其介导LXR的转录激活和SREBP1c的营养和激素调节。然而，LXR-SREBP1c轴是否与长链非编码RNA（lncRNAs）相互作用仍然未知。

    我们以前证明保守的lncRNA Blnc1调节棕色和米色脂肪细胞分化和产热。有趣的是，在肝脏中观察到丰富的Blnc1表达，估计每个小鼠肝细胞约120个拷贝，提高了它可能以组织特异性方式协调不同的代谢反应的可能性。为了探索这一点，我们首先检查了饮食诱导和遗传性肥胖小鼠肝脏Blnc1表达是否发生了改变。定量PCR分析显示，高脂饮食（HFD）喂养的小鼠和瘦蛋白缺乏（ob/ob）和瘦蛋白受体缺陷（db/db）肥胖小鼠的肝脏中Blnc1表达显著升高。Blnc1的这种增加的表达与诱导Srebp1c（脂肪生成的主要调节因子）和脂肪生成基因（包括脂肪酸合酶（Fasn）和硬脂酰-CoA去饱和酶1（Scd1））的增加的表达相关。肝脏Blnc1表达与肥胖和肝脏甘油三酯（TAG）含量强烈相关。与在HFD喂养后表现出更明显的肥胖的那些相比，低体重的获得者在肝脏中具有更低的Blnc1表达。这些结果表明肝脏Blnc1表达与肥胖和肝脏脂肪变性密切相关。

    lncRNAs是否在肝脏脂肪生成和NAFLD发病机制的生理调节中发挥作用尚未建立。原代肝细胞中Blnc1的腺病毒过表达显著增强了合成LXR激动剂T0901317对Srebp1c和Fasn的诱导。与脂肪细胞类似，Blnc1主要定位于肝细胞核中（注意：定位在细胞核说明该lnc与染色体，基因转录等相关）。免疫印迹和qPCR分析显示，Blnc1强烈诱导SREBP1的前体和加工核同种型以及负责从头脂肪生成和脂质储存的基因表达，包括Srebp1c，Fasn，Scd1，Fsp27，Dgat2和Fabp4。此外，Blnc1诱导了几种其他LXR靶基因（Abca1，Abcg5，Lpcat3和Rnf145）的mRNA表达。这些结果表明，Blnc1足以刺激培养的肝细胞和肝脏中的体内新生脂肪生成（注意：对lnc Blnc1进行过表达或敲低，研究Blnc1改变后，脂肪合成/存储相关的基因，调节因子LXR和SREBP1c，及其靶基因的变化。分子水平上说明lnc与脂肪合成相关，与调节脂肪的通路相关）。

    我们观察到Blnc1与LXR协同作用提高了它可能作为驱动肝脏脂肪生成的转录调控网络的关键lncRNA组分的可能性。肝脏基因表达分析表明，Blnc1失活显著降低了Srebp1c，Fasn，Scd1，Fsp27，Abca1和Abcg5的mRNA诱导。LXR激动剂对SREBP1蛋白表达的诱导也在Blnc1 KO小鼠肝脏中减弱。肝脏脂肪生成对于喂食是高度可诱导的。

    由于已知Blnc1调节棕色脂肪产热，重要的是确定它通过细胞自发机制对肝脏脂肪生成发挥作用。我们在从WT和Blnc1缺失小鼠分离的原代肝细胞中进行LXR激动剂治疗。与体内研究类似，LnR介导的脂肪生成反应在Blnc1缺陷型肝细胞中显著受损，导致14C标记的乙酸盐掺入脂质中较低。这些结果有力地表明Blnc1和LXR可协同作用以在肝细胞中引发完全的脂肪生成反应。

    为了确定Blnc1缺陷对肝转录组的全局影响，我们进行了RNA测序分析并鉴定了在Blnc1失活后上调或下调的基因列表（图7a）。GO分析表明，下调的基因富含胶原纤维组织，血管生成，细胞粘附，脂肪生成和细胞死亡，与肝损伤和纤维化相关的通路（图7b）。为了进一步支持这一点，qPCR分析表明，在肝脏特异性Blnc1缺失的小鼠中，参与脂肪生成，肝纤维化和炎症的基因的mRNA表达显著降低（图7c-e）。上调的基因富含环氧化酶p450通路，氧化和还原过程以及脂质和异生物质代谢（图7b），表明Blnc1缺乏可改善肝脏解毒和不同脂质物种的转化。与对照相比，在Blnc1 LKO小鼠肝脏中前体和加工的SREBP1同种型的蛋白质水平降低（图7d）。此外，在Blnc1 LKO小鼠肝脏中减弱JNK1 / 2磷酸化和细胞死亡标记物（PARP和CASPASE 3切割）。总之，这些数据说明了Blnc1在饮食诱导的NASH进展的发病机制中的重要功能。（注意：为了解Blnc1发挥的功能，作者敲低Blnc，而后转录组测序，对得到的差异基因进行GO，KEGG富集分析，发现了一系列与脂肪、肝纤维化，炎症等相关的生物学过程变化，完全符合之前的实验）。

    已知LncRNA形成核糖核蛋白复合物以发挥其生物学作用。接下来，我们采用蛋白质组学方法鉴定与肝脏中的Blnc1物理相关的蛋白质因子。我们在肝特异性TBG启动子下构建了表达链霉抗生物素蛋白适体标记的Blnc1（StA-Blnc1）的重组AAV。我们使用链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠分离来自用对照（AAV-GFP）或AAV-StA-Blnc1转导的小鼠的肝核和亲和纯化的Blnc1相关蛋白，然后进行质谱分析。我们将Y-box结合蛋白1（YBX1）和内皮分化相关因子1（EDF1）鉴定为两种特异性的Blnc1相互作用蛋白。通过对肝脏中内源蛋白质的共免疫沉淀（共-IP）分析证实了StA-Blnc1和YBX1与EDF1之间的相互作用。此外，IP/qPCR研究表明肝脏中内源性YBX1和EDF1的免疫复合物富集了Blnc1 RNA。我们还观察到Blnc1与异种核核糖核蛋白U（hnRNPU）物理结合，这是一种已知与Blnc123相互作用的蛋白质，表明hnRNPU可能是Blnc1核糖核蛋白复合物的核心成分（注意：通过类似RNA pull-down的实验寻找lncRNA结合的蛋白质）。

    EDF1是一种RNA结合蛋白，之前曾报道与核激素受体相互作用，包括LXRα。我们接下来检查了LXRα，EDF1和Blnc1之间的物理和功能关系。我们用单独或组合表达Blnc1和HA标记的EDF1或LXRα的质粒瞬时转染HEK293T细胞，并使用α-HA琼脂糖珠进行IP/qPCR测定。该蛋白质-RNA相互作用测定表明Blnc1与EDF1和LXRα形成物理复合物。Blnc1和LXRα之间的关联似乎是配体非依赖性的。相反，我们在链霉抗生物素蛋白珠沉淀来自瞬时转染的HEK293T细胞的裂解物后检测到Blnc1核糖核蛋白复合物中的EDF1和LXRα。这些蛋白质-RNA相互作用研究表明Blnc1与EDF1和LXR形成核糖核蛋白转录复合物。

    我们接下来解剖了Blnc1的RNA结构域（RD），其介导其与LXRα和EDF1的相互作用。我们以前证明RD1是与hnRNPU和脂肪形成功能相互作用所必需的。有趣的是，该片段的缺失不会损害Blnc1和LXRα与EDF1之间的相互作用。为了评估EDF1可能促进Blnc1募集到LXR转录复合物的可能性，我们进行RNA沉淀，然后在瞬时转染的HEK293T细胞中进行免疫印迹。EDF1的共表达增加了LXRα向沉淀的Blnc1 RNA复合物的募集。一致地，IP/qPCR测定表明通过EDF1共表达显著增加了Blnc1向LXRα的募集。

    已知EDF1充当多种转录因子的转录共激活因子。Blnc1可能促进EDF1对LXR的募集和共活化。为了测试这一点，我们在存在或不存在Blnc1的情况下在HEK293T细胞中转染HA-LXRα和Flag-EDF1。我们检测到LXRα和EDF1之间的物理关联，其通过Blnc1表达进一步增强。与对照肝细胞相比，缺乏Blnc1的肝细胞中LXRα和EDF1之间的物理相互作用显著降低。荧光素酶报告基因测定表明EDF1与LXRα/RXRβ协同作用以刺激Srebp1c启动子活性，并且Blnc1进一步增强该转录复合物的活性。此外，染色质免疫沉淀研究表明，在没有Blnc1的情况下，LXRα向近端Srebp1c启动子上的LXR结合位点的募集受到很大损害。这些结果说明了肝细胞中LXRα，EDF1和Blnc1之间的紧密物理和功能相互作用（注意：作者钓取到Blnc1结合蛋白复合物，根据蛋白复合物，发挥转录因子的功能，使用Chip实验寻找该复合物作用的靶基因）。

    为了确定Blnc1在介导EDF1中的作用，我们使用腺病毒转导在原代肝细胞中过表达EDF1。在基础和LXR激活条件下，肝细胞中的EDF1过表达刺激脂肪生成基因表达。Blnc1的共表达进一步增强了EDF1对脂肪生成基因表达的刺激作用。重要的是，EDF1诱导的脂肪生成基因表达在缺乏Blnc1的肝细胞中显著减弱。最后，我们使用在用GFP或Blnc1腺病毒转导的原代肝细胞中的两个独立的siRNA库进行EDF1的siRNA敲低。qPCR分析显示，与对照相比，两种siRNA均显著降低内源性EDF1表达。重要的是，通过EDF1的siRNA敲低，Blnc1和LXR激动剂对Srebp1c和Fasn表达的诱导显著减弱，表明EDF1是LXR和Blnc1完全脂肪生成激活所必需的。总之，这些结果概述了EDF1促进Blnc1募集和LXR核糖核蛋白转录复合物形成的分子机制（图10d）（Srebp1c是调控与脂质代谢相关基因表达的关键性核转录因子，LXR可以激活该基因表达，LXR蛋白在促进Srebp1c时想必可能不是孤立的，其中可能有lnc, circ或者其他分子形成复合物。假如通过Rip实验钓取LXR的结合RNA，而后进行研究，可能这个文章容易做的多。我们会发现文章的写作思路一般是发现lnc，过表达敲低说明lnc功能，而后寻找lnc结合蛋白，最终寻找的蛋白依然是该生物学过程中明星分子。真实实验中会筛选到几十几百个差异的lnc，要挨个试吗？如果按照这种思路不知道要试验多少个lnc，才能找到一个有重要功能的lnc。每个生物学过程中都会有关键性的蛋白质，转录因子，不妨先从这些蛋白着手，反推调控他的上游分子，而后Rip实验，就能找到那个lnc，circ）。

    肝脂肪生成的异常活化与肥胖，特别是NAFLD中代谢紊乱的发病机理有关。然而，控制脂肪生成程序的生理和病理活化的调节网络仍然未完全了解。LncRNA正在成为一类重要的新型调节因子，它会影响代谢疾病的多种生物过程和发病机制。这些功能性RNA通过形成核糖核蛋白复合物与蛋白质因子结合，以改变染色质结构和基因转录。迄今为止，仅鉴定了少量功能性lncRNA来调节代谢组织发育和代谢生理学。 lncRNAs是否在控制肝脏脂肪生成和NAFLD发病机制中发挥作用仍然是未知的。在本研究中，我们证明Blnc1是LXR / SREBP1c通路的核心组分，是胰岛素抵抗状态下脂肪生成诱导所必需的。

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