Long noncoding RNA OCC-1 suppresses cell growth through destabilizing HuR protein in colorectal cancer

Long noncoding RNA OCC-1 suppresses cell growth through destabilizing HuR protein in colorectal cancer

长非编码RNA OCC-1通过使结肠直肠癌中的HuR蛋白去稳定来抑制细胞生长

期刊：NUCLEIC ACIDS RESEARCH；影响因子：11.561

发表单位：四川大学   

    lncRNA可以通过序列互补的方式结合miRNA发挥ceRNA作用促进靶基因表达。这方面我们解读了大量文献，具体可查看“lncRNA ceRNA机制研究继续”。lncRNA也可与蛋白质直接结合影响蛋白质的修饰过程如磷酸化、泛素化等，调节蛋白质的状态进而影响后续靶标，进而调控细胞生物学过程。本研究通过数据库挖掘到OCC-1在结直肠癌中很重要（如何挖掘数据库：TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA数据挖掘），选择lnc结合蛋白角度研究其机制，发现OCC-1与HuR结合，增强了E3连接酶β-TrCP1与HuR的结合，并使HuR易于泛素化和降解，而HuR的靶基因是一系列的癌细胞生长相关的基因。从而发现OCC-1通过此机制抑制癌细胞生长。

    OCC-1是结肠直肠癌（CRC）中最早注释的长非编码RNA（lncRNA）之一；然而，它的功能仍然很大程度上未知，在这个研究中我们发现OCC-1在CRC中起着肿瘤抑制作用。通过RNA干扰的OCC-1敲低促进体外和体内细胞生长。此外，OCC-1的过表达可以抑制OCC-1敲低细胞中的细胞生长。OCC-1通过与HuR戴白结合并使其不稳定来发挥其功能，该蛋白可以结合并稳定数千种mRNA。OCC-1增强泛素E3连接酶β-TrCP1与HuR的结合，并使HuR易于泛素化和降解，从而降低HuR及其靶mRNA的水平，包括与癌细胞生长直接相关的mRNA。

    长非编码RNA（lncRNA）是一类具有有限蛋白质编码潜力的大转录物。LncRNAs作为染色质修饰复合物和转录因子，蛋白质-蛋白质相互作用支架，蛋白质诱饵，miRNA海绵等，在基因调控的多个步骤中发挥着至关重要的作用。

    为了研究OCC-1在CRC中的临床相关性，我们首先使用来自TCGA数据分析OCC-1表达。结果显示，与原位癌（Tis）和I期肿瘤（P=0.04，图1A，左）相比，具有晚期T期（II期至IV期）的样品中OCC-1表达显著下调。我们还使用GEO微阵列基因表达数据集（GSE39582）分析了OCC-1表达。一致地，在晚期T期肿瘤中OCC-1的水平显著较低（P=0.02，图1A，右）。这些结果表明OCC-1与CRC的早期发展有关。（注意：使用数据库资源寻找重要的lncRNA）。

    我们首先通过RT-qPCR评估六种常见CRC细胞系中OCC-1 RNA的丰度。结果显示在这些CRC细胞中OCC-1 RNA丰富。此外，OCC-1主要定位于Caco-2和HCT116细胞的细胞质中，如通过亚细胞组分分析和RNAscope FISH实验所揭示的（图1B）。为了研究OCC-1功能，我们使用两种独立的短发夹RNA（shRNA，shOCC-1-1和-2）通过RNA干扰敲低OCC-1。结果显示，OCC-1敲低显著增加Caco-2和HCT116细胞中的细胞增殖（图1D）。Ki67染色也证实了增殖的增加，因为在OCC-1敲低细胞中Ki67阳性增殖细胞的比例显著更高（图1E）。OCC-1敲低细胞比其对照细胞形成更多的集落（图1G），这进一步证实了OCC-1在细胞生长中的抑制作用。此外，进行Transwell测定以测试OCC-1对细胞迁移和侵袭的影响。然而，在Caco-2和HCT1116细胞中OCC-1敲低时未观察到细胞迁移和侵袭能力的显著变化。总之，这些结果表明OCC-1抑制细胞生长。（注意：使用细胞系敲低lnc，验证该lnc对细胞增殖，迁移，侵袭的影响）。

    为了测试OCC-1对体内细胞生长的影响，我们通过将OCC-1敲低和对照细胞皮下注射到裸鼠的右侧腹部进行肿瘤发生测定。结果显示OCC-1敲低可加速肿瘤生长。此外，通过Ki67染色确定，OCC-1敲低细胞肿瘤中细胞活力也增加。这些结果表明OCC-1也促进了体内细胞生长。（注意：裸鼠成瘤实验证明lnc敲低促进肿瘤生长）。

    为了深入了解OCC-1的分子功能，我们通过微阵列分析了OCC-1敲低后Caco-2细胞的基因表达。两个独立的shRNA，shOCC-1-1和-2，对基因表达谱表现出相似的效果，〜68％和〜73％的差异表达基因（DEG）相互重叠（图4A）。总的来说，592个基因的表达被两种shRNA破坏，并且大多数（93％，554/592）上调，而只有38个基因下调（图4B）。OCC-1抑制基因的GO富集分析揭示OCC-1主要抑制在转录后和翻译水平起作用的基因表达调节因子，特别是与RNA剪接和转运相关的调节因子（图4C）。我们选择了几种已被报道参与癌症进展的OCC-1抑制基因，并通过RT-qPCR验证了它们的表达。与微阵列分析一致，结果证实在OCC-1敲低后这些选择的基因的水平均适度增加（图4D）。因此，我们认为这些细胞生长相关基因的上调直接导致在OCC-1敲低细胞中观察到的增加的细胞增殖和生长（注意：为了寻找lnc调控分子机制，作者敲低OCC-1，分析基因的表达谱变化，可以很好了解该lnc调控哪些基因，通路，发现RNA剪接和转运相关的调节因子显著变化，也就是lnc的靶基因。但这个方法依然不能知道lnc具体是跟哪个蛋白结合的）。

    为了探索OCC-1在基因表达调控中的非编码功能，我们使用OCC-1 3'UTR作为RNA探针进行RNApull-down测定，以鉴定其蛋白质配偶体。此外，通过RIP实验也在Caco-2细胞中证实了HuR和OCC-1之间的关联。在最近使用PAR-CLIP（可光活化的核糖核苷增强交联和免疫沉淀）绘制HuR结合位点的研究中，还发现OCC-1与HuR相互作用，所有四个CLIP HuR结合位点定位于其3'UTR中。（注意：作者打算从lnc可以结合蛋白质发挥作用的角度阐释该lnc的功能，采用RNA pull-down实验钓取lnc结合蛋白）。

    CLIP研究还定义了一组HuR共有靶mRNA。与通过我们的微阵列分析检测到的OCC-1抑制基因类似，这些HuR靶标中的大多数是在转录后和翻译水平起作用的基因表达调节剂的mRNA。实际上，我们发现OCC-1抑制基因显著富集了那组HuR靶标，其中约74％（408/554）的OCC-1抑制基因也是HuR靶标，包括已经选择用于RT-qPCR验证的所有这六种癌症相关基因。因此，我们进一步检查这些mRNA是否通过RIP测定与Caco-2细胞中的HuR相互作用。如所预期的，结果显示所有这六种选择的mRNA均通过HuR RIP显著富集，表明它们是Caco-2细胞中的HuR靶mRNA。然后，还通过使用先前验证的shRNA敲低HuR来测试HuR对这些mRNA的作用，其导致Caco-2细胞中HuR mRNA和蛋白质水平的显著降低。在HuR敲低后，这些mRNA的水平均略微但显著降低。总之，这些结果表明大多数OCC-1抑制基因是HuR靶标，并且OCC-1可能通过其与HuR蛋白的结合而下调这些mRNA。（注意：找到HuR蛋白后呢，继续研究HuR功能，通过查文献及CLIP实验钓取HuR蛋白结合的mRNA，从而解释芯片筛选到lnc抑制的大部分基因是通过HuR抑制的）。

    鉴于OCC-1对HuR靶mRNA的主要作用，我们推断OCC-1可通过调节HuR蛋白发挥其功能。因此，我们首先确定了OCC-1敲低对Caco-2细胞中HuR mRNA和蛋白质水平的影响。与微阵列分析结果一致，通过RT-qPCR测定，OCC-1敲低对HuR mRNA水平没有明显影响；然而，在OCC-1敲低后，HuR蛋白的水平增加。这些结果表明OCC-1 RNA可以下调HuR蛋白（注意：既然该lnc与HuR直接相关作用，作者敲低lnc，qPCR检测HuR mRNA表达量变化，检测蛋白的变化，发现仅蛋白质表达发生改变，说明lnc影响的是蛋白水平，可能抑制蛋白降解，也可能促进蛋白降解，此处二者是负相关，促进蛋白降解）。

    鉴于HuR蛋白水平受到调节，我们认为OCC-1可能调节HuR蛋白的稳定性。因此，我们用环己酰亚胺（CHX）处理细胞以抑制蛋白质合成并通过蛋白质印迹确定剩余HuR的水平。保留在OCC-1敲低细胞中的HuR部分相对高于对照细胞，表明HuR蛋白在OCC-1敲低后更稳定。由于先前已报道HuR稳定性受泛素蛋白-蛋白酶体通路调节，我们用特异性蛋白酶体抑制剂MG132处理OCC-1敲低细胞，以通过蛋白酶体阻断蛋白质的降解。MG132处理导致OCC-1敲低细胞中HuR的积累达到与对照细胞相当的水平，这表明HuR是蛋白酶体底物，并且HuR的相对较高水平未经处理的OCC-1敲低细胞主要是由于HuR降解的减少（注意：促进蛋白质降解自然联想到蛋白质泛素化过程）。

    然后我们测量了在用表达HA标记的泛素蛋白（HA-Ub）的质粒和表达FLAG标记的HuR（FLAG-HuR）的质粒共转染的OCC-1敲低细胞中HuR的泛素蛋白化。通过HAIP捕获泛素蛋白化的FLAG-HuR蛋白，并使用抗FLAG抗体通过蛋白质印迹检测。在OCC-1敲低细胞中HuR泛素蛋白化的程度显著降低，这表明OCC-1在HuR泛素蛋白化过程中具有正调节作用。因此，我们进一步确定了OCC-1对HuR与其泛素蛋白E3连接酶β-TrCP1结合的影响，其靶向HuR进行泛素化和降解。Co-IP实验表明，OCC-1的敲低减弱了HuR和β-TrCP1之间的相互作用。因此，OCC-1可通过增强HuR和E3连接酶β-TrCP1之间的相互作用来促进HuR泛素化。总之，我们推断OCC-1通过增强其与泛素E3连接酶β-TrCP1的结合来促进HuR的泛素化和降解。

    LncRNA可具有致癌或肿瘤抑制功能。在本研究中，我们发现OCC-1在CRC中抑制体外和体内细胞生长。OCC-1与HuR蛋白结合并使HuR易于泛素化和降解，从而降低HuR及其靶mRNA的水平，包括与癌细胞生长相关的mRNA。我们推断OCC-1主要通过调节HuR蛋白发挥其功能，因为约74％的OCC-1抑制的mRNA是已知的HuR靶标。

    迄今为止，还发现一些lncRNA调节其结合蛋白的翻译后修饰。NKILA是抑制乳腺癌转移的lncRNA，与NF-κB/IκB形成稳定的复合物，直接掩盖IκB的磷酸化基序，从而抑制IκB磷酸化和随后的NF-κB活化。相反，lnc-DC是人类树突细胞分化和功能所需的lncRNA，它阻止转录因子STAT3被SHP1去磷酸化，SHP1是STAT3的蛋白酪氨酸磷酸酶，后者又维持STAT3活性。在Lnc-DC-STAT3相互作用的情况下，Lnc-DC的结合减弱了STAT3和磷酸酶SHP1之间的结合，从而保留了STAT3的磷酸化状态。因此，lncRNA的结合可以影响修饰位点的可用性或翻译后修饰酶与靶蛋白之间的关联。在本研究中，我们发现OCC-1通过增强其与泛素E3连接酶β-TrCP1的结合来促进HuR泛素化，其可以识别HuR并催化其泛素化。

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