Blocking MIR155HG/miR-155 axis inhibits mesenchymal transition in glioma

期刊：NEURO-ONCOLOGY；影响因子：9.384

发表单位：南京医科大学第一附属医院 

    许多lncRNA是miRNA的宿主基因，TCGA等数据库发现许多miRNA宿主lnc显著差异表达，生存曲线显著，那么这类lnc一般怎么研究呢，之前我们介绍过“宿主lncRNA与miRNA是否有关系呢？”，“肿瘤耐药中lncRNA, miRNA是怎么发挥作用的呢”，本研究同样选择lncRNA及其衍生的miRNA的关系进行研究，通过数据库资源挖掘找到MIR155HG，发现其衍生的miR-155抑制protocadherin9和protocadherin7表达，进而激活Wnt/β-catenin通路，促进肿瘤进展。

    背景：MIR155宿主基因（MIR155HG）是一种长链非编码RNA，被认为是miR-155的主要miRNA。MIR155HG在造血，炎症和肿瘤发生中起重要作用。我们的研究调查了MIR155HG/miR-155轴在胶质瘤中的临床意义，生物学功能，机制和小分子抑制剂。

    结果：MIR155HG高表达与胶质瘤分级，间充质转变和预后不良有关。在功能上，通过抑制其衍生物miR-155-5p和miR-155-3p的产生，通过小干扰RNA减少MIR155HG抑制细胞增殖，迁移，侵袭和原位神经胶质瘤生长。生物信息学和荧光素酶报告分析显示，protocadherin9和protocadherin7分别是miR-155-5p和miR-155-3p的直接靶标，后者通过抑制Wnt/β-catenin通路起肿瘤抑制因子的作用。最后，我们将NSC141562鉴定为MIR155HG/miR-155轴的有效小分子抑制剂。

    长链非编码RNA（lncRNA）是非蛋白质编码转录本，长度超过200个核苷酸，在表观遗传调控中发挥关键的分子作用，包括染色质重塑，转录抑制和转录后调控。LncRNA普遍涉及不同的生理和病理过程，如印记，免疫反应，癌症进展和细胞凋亡控制。

    上皮-间质转化是促进肿瘤转移和进展的过程，并且越来越多的研究揭示了它与胶质瘤的发展和进展的关系。由于胶质瘤不是上皮来源，我们更喜欢称之为间充质转变。在目前的研究中，我们发现MIR155HG/miR-155轴与胶质分级，间充质转换和预后不良密切相关，并鉴定了NSC141562，一种有效的小分子抑制剂MIR155HG/miR-155轴。因此，MIR155HG/miR-155轴的致癌功能可以作为神经胶质瘤治疗的潜在靶标。

    为了检测人脑胶质瘤中MIR155HG的表达，我们最初分析了CGGA数据集中5个正常组织和220个神经胶质瘤组织的全基因组基因谱。如图1A所示，与正常组织相比，GBM组织显示MIR155HG转录水平显著增加（P=.0051）。此外，MIR155HG在高分化胶质瘤（HGG）中的表达显著高于低分化胶质瘤（LGG）。我们接下来检查了另一个独立的胶质瘤基因表达数据集REMBRANDT中MIR155HG表达水平与胶质瘤分级之间的关联。我们发现MIR155HG与肿瘤分级显著相关，这与CGGA数据一致。这些发现共同表明MIR155HG可能在胶质瘤进展中发挥重要作用（注意：作者使用CGGA、REMBRANDT两个数据库资源分析到MIR155HG显著差异表达）。

    为了研究MIR155HG表达与总体存活之间的相关性，我们在CGGA和REMBRANDT数据集中进行了对数秩比较的Kaplan-Meier生存曲线分析。我们发现MIR155HG的高表达与总体存活率呈负相关（P=.0196，图1B）。在REMBRANDT数据中检测到类似的结果（P=.0065）。这些数据表明MIR155HG的过表达赋予GBM患者预后不良。

    然后，我们进行了多变量Cox比例风险模型，以评估有助于总体生存的因素。MIR155HG表达，KPS评分和增殖细胞核抗原表达与总生存率无关，当考虑年龄，切除，表皮生长因子受体，Ki-67，拓扑异构酶II型和谷胱甘肽S-转移酶pi，这些结果一起暗示MIR155HG可以作为GBM患者的独立预后因素。

    使用来自CGGA数据集的表达数据，我们在高MIR155HG表达组中鉴定了1858个上调基因和2120个下调基因（注意：一个很巧妙的处理方式，如果肿瘤样品比较多，将肿瘤组织依据该基因分成高表达组和低表达组进行差异比较分析，不就相当于做了过表达/敲低实验吗）。我们将这些基因命名为“MIR155HG差异表达基因”。我们进行了GSEA以验证我们是否能够检测CG在CGGA数据中列出的间充质转换相关基因的差异，我们发现与LGG相比这些基因确实在HGG中显著富集。此外，MIR155HG差异表达基因的GSEA在GBM的高MIR155HG表达样品中显示出间充质转换相关基因的显著富集。

    然后进行GSEA以鉴定基因GO富集、KEGG通路富集，这些通路由高MIR155HG表达组和低表达组之间的MIR155HG差异表达基因差异调节。GSEA结果揭示了许多间充质转换相关类别（细胞外基质，细胞外区域，细胞迁移，对创伤的反应，细胞外基质受体相互作用和粘着斑）。此外，GSEA表明6种不同的已发表的间充质转换相关基因信号通路在高MIR155HG表达样本中显著富集，强烈表明MIR155HG诱导了普遍和持续的间充质转换信号程序（注意：机制研究通常要关联通路，如果有基因表达谱，通过GSEA、GO、KEGG富集等方法可关联到通路）。

    来自患者的10个NBT和10个原发GBM样品用于通过RT-PCR检测MIR155HG的表达状态。如图1E所示，与NBT水平相比，这些GBM标本中MIR155HG的水平显著上调（P<.0001）。我们从Cheng的列表中选择了3个间充质转换相关标记（POSTN，MMP11和FN1），发现具有高MIR155HG表达（n = 5）的GBM中的表达水平高于具有低MIR155HG表达的那些（n = 5）（图1F）。接下来，为了直接测试MIR155HG在间充质转换中的功能作用，MIR155HG被神经胶质瘤细胞中的特异性siRNA下调。MIR155HG减少引起β-连环蛋白，N-钙粘蛋白，波形蛋白和基质金属蛋白酶9的显著降低（图1G）。这些结果强烈证明MIR155HG是间充质转换相关的lncRNA（注意：lncRNA影响了哪个通路？LncRNA的表达量变化显著改变了某个通路的基因尤其是重要基因，他就改变了哪个通路）。

    与NC细胞相比，用siMIR155HG转染后，U87，U251和原代GBM细胞中的细胞增殖被显著抑制。与NC相比，用siMIR155HG转染的神经胶质瘤细胞显著减少了划痕伤口愈合和较低的侵袭能力。为了进一步检查肿瘤生长是否被siMIR155HG抑制，我们在体内使用U87原位胶质瘤模型进行分析。在Lenti-NC和Lenti-siMIR155HG处理组之间检测到生物发光成像所显示的肿瘤体积的统计学显著差异。此外，用Lenti-siMIR155HG治疗与小鼠的存活时间显著延长相关。

    MIR155HG是miR-155的主要miRNA，因此我们接下来检查miR-155表达。MIR155HG敲低显著降低了U87和原代GBM细胞中miR-155-5p和miR-155-3p的表达。Pearson相关性分析显示在158个胶质瘤和64个GBM组织中MIR155HG和miR-155-5p或miR-155-3p之间显著且正相关。单因素方差分析显示，miR-155-5p和miR-155-3p均与肿瘤分级显著相关，且GBM中的表达水平高于LGG。此外，miR-155-3p的高表达与GBM患者的较差存活结果相关（P=.0448），而miR-155-5p表达与总体存活无显著相关性。miR-155-5p或miR-155-3p的表达分别被抗miR-155-5p或抗miR-155-3p转染下调，细胞增殖，迁移，在胶质瘤细胞中显著抑制和侵袭。

    为了确定与MIR155HG相关的表型是否由miR-155-5p和miR-155-3p介导，我们用miR-155-5p或miR-155-3p模拟物共转染siMIR155HG。miR-155-5p或miR-155-3p的过表达显著逆转了siMIR155HG诱导的细胞增殖，迁移和侵袭的抑制。总的来说，这些数据表明miR-155-5p和miR-155-3p是MIR155HG在胶质瘤中生物学功能的重要参与者。

    为了探索miR-155-5p和miR-155-3p的下游靶标，我们使用2种在线算法TargetScan和microRNA进行生物信息学分析，以预测mRNA靶标。我们发现PCDH9在其3'非翻译区（UTR）中含有miR-155-5p的推定结合位点，PCDH7含有miR-155-3p的潜在结合位点。CGGA数据显示miR-155-5p和PCDH9之间以及miR-155-3p和PCDH7之间显著负相关。此外，胶质瘤细胞中miR-155-5p或miR-155-3p表达降低导致PCDH9或PCDH7蛋白增加。荧光素酶报告基因测定显示，miR-155-5p的过表达导致PCDH9-3'UTR野生型构建体在U87细胞中的荧光素酶活性显着降低，而PCDH9-3'UTR突变体的荧光素酶活性没有变化，其含有推定的结合位点的突变。用miR-155-3p观察到类似的数据。我们的结果强烈表明PCDH9和PCDH7分别是miR-155-5p和miR-155-3p的直接靶标（注意：寻找miRNA的靶基因，1）先用软件如TargetScan预测，2）qPCR确定miRNA与靶基因是否是负相关，3）而后荧光素酶报告基因实验证实，4）靶基因过表达敲低实验证明其在肿瘤进展中的作用）。

    为了测试PCDH9和PCDH7是否介导胶质瘤细胞中miR-155的生物学功能，PCDH9和PCDH7表达载体用于营救实验。通过蛋白质印迹验证PCDH9和PCDH7的过表达。PCDH9和PCDH7的过表达抑制了胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭。这些结果与miR-155减少的效果一致（注意：此处PCDH9和PCDH7过表达证明两个基因在肿瘤进展中发挥重要作用）。此外，当细胞与miR-155-5p和PCDH9，或miR-155-3p和PCDH7共转染时，miR-155在促进细胞增殖，迁移和侵袭方面的作用显著减弱。这些结果进一步表明PCDH9和PCDH7是miR-155的功能性下游靶标。

    为了研究潜在的机制，我们对潜在的中介因子进行了蛋白质印迹分析。结果显示PCDH9和PCDH7的过表达显著下调β-catenin和cyclinD1的表达，并增加磷酸化β-catenin的水平（pβ-连环蛋白）。此外，同时过表达miR-155-5p / -3p和PCDH9 / 7消除了miR-155-5p / -3p引起的β-catenin下调和β-catenin及cyclin D1的上调。总之，这些数据支持这样的观点，即作为miR-155直接靶标的PCDH9和PCDH7通过抑制Wnt/β-catenin信号传导通路起到肿瘤抑制基因的作用（注意：PCDH9和PCDH7过表达显著抑制Wnt/β-catenin通路中重要的蛋白β-catenin和cyclinD1下调，从而关联到Wnt/β-catenin）。

    MIR155HG已被定性为涉及多种生理和病理过程的重要调节因子，如造血，炎症，免疫和肿瘤的发生和发展。在我们的研究中，MIR155HG与肿瘤分级呈正相关，并且代表了GBM患者的独立不良预后因素。MIR155HG抑制在体外和体内抑制胶质瘤生长。GSEA和体外实验证明MIR155HG调节间充质转化进程。

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