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Mesenchymal stem cells promote hepatocarcinogenesis via lncRNA-MUF interaction with ANXA2 and miR-34a

文字:[大][中][小] 2018/10/25     浏览次数:    

Mesenchymal stem cells promote hepatocarcinogenesis via lncRNA-MUF interaction with ANXA2 and miR-34a

间充质干细胞通过lncRNA-MUF与ANXA2和miR-34a相互作用促进肝癌发生


期刊:CancerResearch;影响因子:9.13            

发表单位:北京工业大学 


导 读

    间充质干细胞有助于肝细胞癌的发展和转移,那么在发展和转移过程中是否有lncRNA发挥作用呢,本研究通过lnc表达谱发现lncRNA-MUF发挥重要作用,机制上lncRNA-MUF既可以直接与蛋白ANXA2结合激活Wnt/β-catenin信号和EMT通路,另外,lncRNA-MUF可以竞争性结合miR-34a发挥ceRNA作用上调Snail1表达,促进EMT过程

  

摘 要

    越来越多的证据表明癌症相关的间充质干细胞(MSC)有助于肝细胞癌(HCC)的发展和转移。我们鉴定了一种新的lncRNA,我们称之为lncRNA-MUF,其在HCC组织中高度表达并且与不良预后相关。在HCC细胞中敲低lncRNA-MUF抑制EMT并抑制其致瘤潜力。相反,lncRNA-MUF过表达加速了EMT和恶性能力。机理研究表明,lncRNA-MUF结合膜联蛋白A2ANXA2)并激活Wnt/β-catenin信号和EMT。此外,lncRNA-MUF充当miR-34a的竞争性内源RNAceRNA),导致Snail1上调和EMT活化。

 

背景介绍

    肝细胞癌(HCC)是全球第五大常见癌症,也是全球癌症相关死亡的第三大原因。越来越多的证据表明,lncRNA可通过多种机制参与许多生理或病理过程,包括RNA-蛋白或RNA-RNA相互作用。据报道,失调的lncRNA可调节HCC增殖,转移和复发。然而,lncRNAMSC介导的肝癌发生中的作用仍然未知。

  

结 果

1

HCC-MSCs促进肝癌干性和肿瘤发生

    癌症相关的MSCs作为肿瘤微环境的重要组成部分正日益受到重视,但HCC-MSCsHCC进展中的作用报道较少。在这里,我们发现HCC-MSCs通过Transwell共培养系统显著增强HCC细胞的肿瘤球形成。我们研究了HCC-MSCHCC细胞(GFP)之间相互作用的影响。流式细胞术分析显示癌症干细胞(CSC)标志物如CD90CD13HCC-MSC显著诱导。为了进一步评估体内HCC-MSCCSC促进作用,通过在裸鼠中皮下接种荧光素酶标记的SMMC-7721细胞,与HCC-MSC混合或不与HCC-MSC混合,进行有限稀释致瘤性测定。

    当皮下接种1×106SMMC-7721HepG2细胞时,HCC-MSC共接种组中的肿瘤重量显著增强。此外,肝脏部位的生物发光强度和转移性结节均表明HCC-MSC显著促进体内转移。这些结果提供了强有力的证据,表明当与HCC-MSC共培养时,HCC细胞转变为更具攻击性的表型


2

HCC细胞中的LncRNA-MUFHCC-MSC显著上调

    为了解HCC-MSCs如何促进HCC进展的机制,我们使用微阵列分析来评估与HCC-MSC共培养的HCC细胞中lncRNAmRNA的变化(图2A)。转录组谱分析鉴定出当与HCC-MSC共培养时,57lncRNA转录物(图2B)和110mRNA在三种不同的HCC细胞系中差异表达。转录组数据已经保存在Gene Expression OmnibusGEO)数据库(GSE86160)中。到目前为止,大多数lncRNA仍然没有表征,我们首先研究了由HCC-MSC诱导的HCC细胞的改变的mRNA。基因集富集分析(GSEA)和基因本体论(GO)均表明差异表达的mRNA富含细胞外基质,与EMT信号传导和转移密切相关。另外,qPCR和蛋白质印迹试验证实,HCC-MSC条件培养基显著上调EMT相关基因。TGF-β1是一种表征良好的EMT诱导剂,可作为阳性对照。我们的研究结果表明,HCC-MSCs可能通过EMT过程在很大程度上促进HCC恶性肿瘤

    为了进一步鉴定哪些lncRNA可能在促进HCC进展的HCC-MSC中起重要作用,使用以下标准筛选候选lncRNAlncRNA微阵列中的HCC-MSC显著改变的lncRNA(图2B;和癌症基因组图谱(TCGA)数据库表明与邻近的非肿瘤组织相比,HCC样本中lncRNA的差异表达(图2C)。在五种最差异表达的lncRNA中,新的lncRNALINC00941EnsemblIDENSG00000235884,倍数变化>5P<0.01特别引起我们的注意(图2D)。由于这是一种无特征的lncRNA,我们将其称为lncRNA-MUF。与微阵列结果一致,qPCR测定证实HCC-MSCHCC细胞中lncRNA-MUF显著上调。另外,与邻近的非肿瘤组织相比,它在HCC样本中高度表达(图2E)。TCGA数据(图2F)和我们之前的lncRNA微阵列证实了这些结果。值得注意的是,Kaplan-Meier生存分析表明高lncRNA-MUF表达与HCC患者的不良生存相关(图2F)。此外,HCC-MSC条件培养基和TGF-β1显著增强了lncRNA-MUF的表达(图2G)。此外,lncRNA-MUF在肿瘤球和高侵袭性HCC细胞中高度表达(图2G)。总之,这些发现表明lncRNA-MUFHCC-MSC显著上调


3

肿瘤球形成和EMT过程需要LncRNA-MUF

    通过cDNA末端测定(RACE)的5'3'快速扩增确定1884碱基对(bp)转录物,并且显示无编码潜力,如通过CNCICPATPhyloCSF评分分析所确定的。细胞组分RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)分析表明lncRNA-MUF定位于细胞质中敲除lncRNA-MUF显著减弱了体外肿瘤球形成和侵袭的能力。此外,lncRNA-MUF敲低显著抑制了体内皮下异种移植物形成和转移能力。相反,在lncRNA-MUF过表达细胞中肿瘤球形成增加。鉴于HCC-MSCs刺激EMT过程,我们检测了lncRNA-MUF改变后EMT相关基因的表达。qPCR和蛋白质印迹均证明lncRNA-MUF敲低显著抑制间充质相关基因的表达,而lncRNA-MUF过表达具有相反的作用。总之,这些数据表明lncRNA-MUF可以调节EMT程序以促进HCC进展。


4

lncRNA-MUFANXA2相互作用

    LncRNAs可通过RNA-蛋白质相互作用发挥功能,调节靶基因。因此,我们利用RNA pull-down测定,然后银染和质谱(MS)来鉴定lncRNA-MUF-蛋白相互作用。发现ANXA2特异性结合lncRNA-MUF通过RNA pull-down测定然后进行蛋白质印迹,在生物素标记的有义lncRNA-MUF组中检测到ANXA2。此外,通过RNA免疫沉淀(RIP)测定验证了lncRNA-MUFANXA2之间的相互作用。另外,构建一系列截短的lncRNA-MUF以绘制lncRNA-MUFANXA2之间的特异性结合区域,表明lncRNA-MUF的核苷酸8001600可以结合ANXA2竞争性RNA pull-down测定进一步证实了ANXA2lncRNA-MUF的相互作用。此外,RNA-FISH和免疫荧光测定表明lncRNA-MUFANXA2HCC细胞的细胞质中共定位。GEO数据显示ANXA2HCC组织和转移样品中高度表达ANXA2的消耗显著抑制肿瘤球形成和致肿瘤性。这些数据表明lncRNA-MUF-ANXA2轴可以调节HCC进展。


5

lncRNA-MUFANXA2相互作用以激活Wnt/β-连环蛋白信号传导

    为了研究lncRNA-MUF-ANXA2轴促进HCC进展的机制,我们检查了ANXA2改变后EMT相关基因的表达。通过ANXA2过表达或敲低显著改变间充质相关基因和β-连环蛋白。不同细胞区室中的β-连环蛋白介导不同的细胞功能,因此我们确定ANXA2是否影响β-连环蛋白的亚细胞分布。蛋白质印迹分析显示过表达ANXA2的细胞的胞质溶胶和细胞核中β-连环蛋白的增加。相反,在ANXA2敲低细胞中,细胞核中的β-连环蛋白显著降低。此外,我们研究了lncRNA-MUF的效果在GSK-3βANXA2之间的相互作用,并发现lncRNA-MUF的敲低抑制ANXA2β-cateninEMT相关蛋白的促进作用。另外,co-IP测定证实,lncRNA-MUF过表达显著增强ANXA2GSK-3β之间的相互作用,而lncRNA-MUF消耗抑制结合效应。对lncRNA-MUF截短的分析表明,GSK-3β而非β-连环蛋白与lncRNA-MUF的核苷酸8001200结合,表明lncRNA-MUF通过不同但部分重叠的结构域与ANXA2GSK-3β相互作用。总之,lncRNA-MUFANXA2的结合在Wnt /β-连环蛋白信号传导和EMT过程的激活中起重要作用


6

lncRNA-MUF通过充当miR-34aceRNA来促进HCC进展

    新出现的证据表明,细胞质lncRNA可以作为调节miRNA功能的ceRNA。为了检查细胞质定位的lncRNA-MUF是否可以结合内源性miRNA,我们使用PITARNAhybrid软件预测了靶miRNA。仅选择具有高等级靶位点和在HCC组织中低表达的miRNA用于进一步分析。RIPRNA pull-down测定显示,与对照相比,miR-34amiR-133alncRNA-MUF组中显著富集。我们的初步结果显示miR-34amiR-133a显著地抑制肿瘤球形成。因此,我们主要关注lncRNA-MUFmiR-34a结合的影响。荧光素酶活性和AGO2RIP测定显示lncRNA-MUF可与miR-34a结合。此外,RNA-FISH分析证明lncRNA-MUFHCC细胞的细胞质中的miR-34a共定位。接下来,我们发现miR-34a抑制肿瘤球形成和HCC细胞的肿瘤生长。此外,当lncRNA-MUFmiR-34a共转染到HCC细胞中时,lncRNA-MUF显著地挽救了miR-34a对肿瘤球形成和侵袭的抑制作用。此外,qPCR和蛋白质印迹分析显示lncRNA-MUF可以恢复miR-34aEMT过程的抑制作用。这些数据表明在HCC细胞中lncRNA-MUF作为影响miR-34a功能的ceRNA


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lncRNA-MUF-miR-34a轴通过Snail1促进HCC恶性肿瘤

    为了进一步阐明lncRNA-MUF-miR-34a轴对HCC进展的贡献的机制,Target Scan软件预测Snail1miR-34a的靶标之一。并且miR-34a显著抑制Snail1HCC细胞中的表达,荧光素酶报告基因测定表明miR-34a可以结合Snail13'非翻译区(UTR)。重要的是,lncRNA-MUF减弱了miR-34aSnail13'UTR的结合能力。此外,Western印迹分析证实,lncRNA-MUF可降低miR-34aSnail1表达的抑制作用。另外,Snail1敲低抑制由lncRNA-MUF过表达诱导的肿瘤球形成。qPCR和蛋白质印迹分析证明Snail1敲低抑制了lncRNA-MUFEMT进展的促进作用。总之,这些数据显示lncRNA-MUF可以作为miR-34aceRNA起作用以调节Snail1的表达并增强EMT过程。

  

讨 论

    在这项研究中,我们研究了lncRNAs在促进HCC进展的HCC-MSCs中的作用。有趣的是,我们发现HCC-MSCHCC细胞中新的lncRNA-MUF显著增加。此外,lncRNA-MUF显著促进肿瘤发生和EMT特征。在机理上lncRNA-MUFANXA2miR-34a相互作用以参与EMT过程和肿瘤发生。总的来说,该研究的结果提供了一种新的机制,通过该机制,HCC-MSC促进HCC进展。



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