Long non-coding RNA UICLM promotes colorectal cancer liver metastasis by acting as a ceRNA for microRNA-215 to regulate ZEB2 expression

Long non-coding RNA UICLM promotes colorectal cancer liver metastasis by acting as a ceRNA for microRNA-215 to regulate ZEB2 expression

长链非编码RNA UICLM通过作为microRNA-215的ceRNA调节ZEB2表达来促进结直肠癌肝转移

期刊：Theranostics；影响因子：8.537 

发表单位：中山大学             

    lncRNA 通过ceRNA机制竞争性结合miRNA保护靶基因mRNA的表达。之前我们介绍过许多研究lncRNA ceRNA机制的文献。本研究发现lncRNA UICLM在结肠直肠癌肝转移过程中发挥重要作用，机制发现UICLM充当miR-215的竞争性内源RNA（ceRNA）以调节ZEB2表达。

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    长链非编码RNA（lncRNA）参与各种肿瘤的病理学，包括结肠直肠癌（CRC）。然而，lncRNA在CRC肝转移中的作用仍不清楚。

    方法：进行微阵列鉴定具有和不具有肝转移的CRC组织之间差异表达的lncRNA。使用Kaplan-Meier方法评估存活分析。进行体外和体内测定以探索差异表达的lncRNA在CRC细胞中的生物学效应。

    结果：在患有肝转移的CRC病例中，lncRNA UICLM（在结直肠癌肝转移中上调）显著上调。此外，CRC组织中UICLM表达高于正常组织，UICLM表达与患者存活率差有关。UICLM的敲低抑制了体外的CRC细胞增殖，侵袭，上皮-间质转化（EMT）和CRC干细胞形成以及体内肿瘤生长和肝转移。UICLM的异位表达促进了CRC细胞的增殖和侵袭。机理研究表明，UICLM通过调节ZEB2诱导其生物学效应，因为UICLM促进的肿瘤发生受到ZEB2消耗的抑制。进一步研究表明，UICLM充当miR-215的竞争性内源RNA（ceRNA）以调节ZEB2表达。

    结直肠癌(CRC)是全球第二大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第三大原因。已经发现lncRNA在哺乳动物细胞以及植物细胞中大量转录。这些lncRNA可以充当其他生物分子的指导，支架，诱饵和系链，并且参与各种生物过程，例如细胞生长，细胞分化，细胞凋亡，细胞侵袭和干细胞多能性。越来越多的证据表明，lncRNA表达谱可以用作不同肿瘤的诊断和预后工具，例如前列腺癌，乳腺癌，胃癌和CRC。虽然已经注释了越来越多的lncRNAs，但lncRNAs在CRC肝转移中的作用和分子调控机制仍不清楚。

    为了研究CRC肝转移中涉及的lncRNA表达谱，我们对15个CRC组织进行了lncRNA微阵列分析（7例肝转移，8例在诊断时和2年随访期间没有肝转移）。我们在两组之间鉴定了493个差异表达的lncRNA，包括上调和下调的lncRNA（图1A）。实时PCR结果证实，与没有肝转移的CRC中的表达相比，这些lncRNA中的9个在具有肝转移的CRC中显著过表达。在另外122个CRC患者的更大样品中检测到上述9个lncRNA的表达。只有lncRNA LOC200772在具有肝转移的CRC中显著上调。由于其功能在CRC中仍未被表征，因此我们将其指定为lncRNA UICLM（在结肠直肠癌肝转移中上调）。此外，与其在相邻的非肿瘤组织中的表达相比，肿瘤组织中UICLM表达显著增加，并且在晚期肿瘤阶段患者中也观察到增加的表达（*P<0.05，**P<0.01，图1C和D）。同样地，UICLM的表达在CRC细胞中比在永生化结肠上皮细胞系CCD-112CoN中更高（*P<0.05，**P<0.01，图1E）。亚细胞组分分离和实时PCR分析显示UICLM主要位于细胞质中。UICLM表达与肿瘤大小（P=0.004），肝转移（P=0.002）和TNM分期（P=0.008）显著相关。UICLM与年龄，性别，肿瘤深度，组织学分级或淋巴结侵犯无相关性。Kaplan-Meier生存曲线显示UICLM水平高的患者无进展生存期较差（分别为P=0.01和P=0.075，图1F和H）。

    使用特异性siRNA敲低两种具有相对高的UICLM表达的CRC细胞系SW620和DLD-1中的UICLM表达。CCK-8测定显示，UICLM的敲低显著抑制SW620和DLD-1细胞的增殖，而UICLM的异位表达增加HCT116和HT-29细胞的增殖。集落形成试验也证实，UICLM敲低显著降低了SW620和DLD-1细胞中的集落形成数量，而UICLM的异位表达增加了HCT116和HT-29细胞中的集落形成数量。SW620sh-UICLM细胞（n=10）形成的肿瘤的肿瘤体积和肿瘤重量与SW620sh-NC细胞（n=10）形成的肿瘤体积和重量相比显著降低。ISH分析证实UICLM的敲低降低了体内UICLM表达，并且IHC分析显示UICLM的敲低显著降低Ki-67表达。

    transwell测定表明，UICLM的敲低显著抑制SW620和DLD-1细胞中的细胞迁移和侵袭，而UICLM的异位表达显着增加HCT116和HT-29细胞的细胞侵袭。伤口愈合测定还表明，UICLM的敲低显著降低了SW620和DLD-1细胞中的细胞迁移。由于EMT在细胞迁移和侵袭中起重要作用，我们测试了UICLM是否影响CRC细胞中的EMT。免疫荧光分析显示，UICLM的敲低降低了N-钙粘蛋白的表达，而E-钙粘蛋白的表达增加。实时PCR结果证实，UICLM的敲低显著降低了间充质标记物（N-钙粘蛋白，Vimetin，Snail，Slug）的表达，同时增加了上皮标记物（E-钙粘蛋白，α-连环蛋白，β-胱氨酸）的表达。相反，UICLM的异位表达显著促进HCT116和HT-29细胞的细胞侵袭，并增加间充质标记物（N-钙粘蛋白，Vimetin，Snail，Slug）的表达，同时降低上皮标志物的表达（E-钙粘蛋白，α-连环蛋白，β-连环蛋白）。

    为了评估UICLM在调节CRC细胞的干性中的作用，可以使用可以排除Hoechst33342染料的荧光激活细胞分选（FACS）技术来分离CRC侧群（SP）细胞。结果显示，敲低UICLM可显著降低SW620和DLD-1细胞中的SP细胞比例。此外，进行功能测定以测试UICLM是否可以增加CRC细胞的干性。结果显示，UICLM的敲低显著减少了SW620和DLD-1细胞中的球形成。此外，敲除UICLM可显著下调许多与干细胞相关的基因（Nanog，Oct-4，SOX2和Notch1），多种耐药转运基因（ABCG2）和与癌症干细胞相关的表面抗原（CD24，CD44，CD133，CD155和CD166）。

    为了研究UICLM与CRC进展和转移相关的分子机制，我们探索了具有敲低的UICLM表达的CRC细胞的基因表达谱。用UICLM的特异性siRNA处理SW620细胞，并通过RNA测序测量所有mRNA的表达水平。通过基因集富集分析（GSEA）确定UICLM相关途径，其确定不同途径是否显示两组之间的统计学显著差异。“细胞迁移和侵袭”途径被指定为最高的富集分数。通过分析来自我们的lncRNA/mRNA微阵列数据集的UICLM和mRNA之间的相关性，我们发现ZEB2在该途径中被赋予最高的相关系数。此外，在RNA测序分析中，ZEB2是在SW620细胞中敲除UICLM后最下调的基因之一。基于这些结果，我们假设UICLM和ZEB2之间可能存在相关性。ZEB2和UICLM的表达水平之间发现了正相关。

    已知lncRNA可以作为竞争性内源RNA（ceRNA）起作用，通过竞争其靶向微小RNA来保护mRNA。因此，我们调查了UICLM是否发挥了这样的作用。使用生物信息学（miRcodeStarbasev2.0和RNAhybrid）工具，我们发现了7种推定与UICLM结合的miRNA。在这些候选miRNA中，miR-215可直接与UICLM和ZEB2结合。我们发现miR-215的过表达显著抑制UICLM表达，而UICLM的敲低显著增加miR-215的表达。我们还进行了实验以确定UILCM是否会影响miR-215的处理。由于UICLM位于细胞质中，我们寻找UICLM是否可以调节pre-miR-215的表达。结果显示，SW620和DLD-1细胞中UICLM的敲低不影响pre-miR-215的表达。双荧光素酶测定表明共转染后荧光素酶活性显著降低。

    远处转移的发展是一个复杂的过程，涉及多种遗传和表观遗传改变的积累，导致癌基因的激活或肿瘤抑制基因的失活。越来越多的证据表明lncRNAs在肿瘤进展和转移中起重要作用。在本研究中，我们鉴定了一组参与CRC肝转移病理学的lncRNA，在这些lncRNAs中，UICLM是有和没有肝转移的CRC之间最差异表达的lncRNA之一，表明它在其中起关键作用。CRC肝转移的生物学过程。据我们所知，这是第一项系统评估lncRNA在CRC肝转移中的作用的研究。

文献解读：LncRNA-PAGBC ceRNA机制促进胆囊肿瘤发生

文献解读：Hepatology: lncRNA稳定miRNA抑制mRNA表达（IF:14.079）

文献解读：食管癌lncRNA-TTN-AS1竞争性结合miR-133b上调Snail1的表达，促进EMT过程

文献解读：lncRNA ceRNA机制中 lnc，miRNA进化保守性