LncRNA-PAGBC acts as a microRNA sponge and promotes gallbladder tumorigenesis

LncRNA-PAGBC acts as a microRNA sponge and promotes gallbladder tumorigenesis

LncRNA-PAGBC充当microRNA海绵并促进胆囊肿瘤发生

期刊：EMBO Reports；影响因子：8.749                

发表单位：上海交通大学医学院附属新华医院    

     lncRNA可以通过ceRNA机制调控靶基因的表达，进而调控通路变化影响细胞的增殖迁移等。本研究通过芯片筛选，基因共表达分析发现lncRNA-PAGBC是很重要的分子，生信预测其结合的microRNA位点，结合基因表达量变化，基因功能，及miRNA靶基因预测，找到SOX4和PIK3R3是ceRNA的靶基因。该靶基因参与AKT/mTOR通路，调控细胞增殖转移。 

     长非编码RNA（lncRNA）在许多癌症的发展和进展中起作用；然而，lncRNAs在人类胆囊癌（GBC）的作用仍然很大程度上未知。在本研究中，我们在人类GBC组织中鉴定了一组差异表达的lncRNA，包括预后相关的胆囊癌lncRNA（lncRNA-PAGBC），我们发现它们是GBC中的独立预后标志物。功能分析表明lncRNA-PAGBC促进GBC细胞的肿瘤生长和转移。更重要的是，作为竞争性内源RNA（ceRNA），lncRNA-PAGBC竞争性地结合肿瘤抑制性microRNA miR-133b和miR-511。lncRNA-PAGBC的这种竞争作用是其促进肿瘤生长和转移以及激活AKT/mTOR途径的能力所必需的。此外，lncRNA-PAGBC与多腺苷酸结合蛋白细胞质1（PABPC1）相互作用，并通过这种相互作用稳定。这项工作提供了GBC分子发病机制的新见解。   

     胆囊癌（GBC）是全球最常见的胆道癌和第六种最常见的胃肠道癌。由于其非特异性症状和高度侵入性，GBC通常在晚期被发现。近年来，来自不同机构的研究表明，长链非编码RNA（lncRNAs）通过各种机制参与许多生理和病理过程，尤其是在不同癌症的发生和发展过程中。因此，研究lncRNA在GBC中的作用可以帮助理解肿瘤发生和鉴定新的诊断和治疗靶标。

lncRNA以复杂的方式作为表观遗传调节，转录和翻译的关键调节因子以时空方式。最近，已经提出了竞争性内源RNA（ceRNA）的作用。在该模型中，lncRNA可通过竞争性结合miRNA反应元件（MRE）来影响转录后调控，从而影响其他mRNA或lncRNA转录物。  

结 果

     总共7,798个lncRNA和7,290个蛋白质编码RNA被鉴定为在9对GBC和非肿瘤样品之间差异表达。分层聚类证明了GBC和配对的非肿瘤样品之间的lncRNA和mRNA的表达水平的系统变化。在GBC中差异表达的前60个lncRNA和mRNA的热图显示在图1A中。为了验证微阵列结果的可靠性，四个随机选择的lncRNAs和lncRNA-MALAT1表达在肿瘤相应的非肿瘤样品进行分析。结果证实BC010117，NR_038835和MALAT1在GBC样品中高度表达，而AC240664.3和ENST00000415656在非肿瘤样品中失调（图1B）。

     使用基因共表达网络将各种转录物聚类成表型相关的共表达模块。GBC和非肿瘤样品的共表达网络的结构差异表明GBC和非肿瘤样品中lncRNA和mRNA表达水平的变化。考虑到生物学相关的基因在癌症发展过程中倾向于显示相似的变化模式，我们专注于具有高共表达蛋白质编码RNA的lncRNAs。lncRNA-PAGBC在GBC组织中高表达，与17个lncRNAs和30个蛋白质编码基因相关，倍数变化≥10.0，P值≤0.05参与共表达网络中的肿瘤生长和转移。

     对60对人GBC组织和相应的非肿瘤组织进行qRT-PCR，结果表明GBC组织中lncRNA-PAGBC转录水平显着高于相应的非肿瘤组织（图1D）。77个人GBC组织中的lncRNA-PAGBC表达发现更高水平的lncRNA-PAGBC表达与更晚期的肿瘤阶段相关。Kaplan-Meier分析表明具有较高lncRNA-PAGBC表达水平的GBC患者表现出显着降低的总存活率（OS）（P <0.001，图1E，上图）。

     通过快速扩增cDNA末端（RACE）分析证实了lncRNA-PAGBC的全长。荧光原位杂交和RT-PCR结果表明该lncRNA主要位于细胞质中（图1G和H）。总的来说，这些数据表明lncRNA-PAGBC可能发挥GBC致癌作用。

     为了确定lncRNA-PAGBC在GBC细胞系中的生物学功能，我们稳定地敲除了NOZ和GBC-SD细胞中的lncRNA-PAGBC。在lncRNA-PAGBC沉默后NOZ和GBC-SD细胞的增殖被显着抑制。此外，使用皮下异种移植模型，结果表明，lncRNA-PAGBC耗尽的异种移植物的肿瘤的生长被显着抑制。另外，lncRNA-PAGBC的外源过表达在体外和体内均促进GBC细胞增殖和肿瘤形成。这些结果表明，lncRNA-PAGBC在体外和体内均可调节GBC细胞增殖。

总之，这些数据显示lncRNA-PAGBC促进GBC细胞中的肿瘤生长和转移。

     为了探索lncRNA-PAGBC是否可以作为ceRNA起作用，我们使用Segal Lab程序预测了lncRNA-PAGBC中可能的结合位点。结果显示lncRNA-PAGBC含有近1,000个潜在的miRNA结合位点，表明lncRNA-PAGBC可能充当ceRNA。根据该结果的指示和我们之前的GBC相关miRNA微阵列结果，我们进一步缩小我们的结果miR-133b，miR-150，miR-511，miR-625，miR-765和miR-1258作为结合lncRNA-PAGBC的最可能的候选者。

     为了验证这些miRNA与lncRNA-PAGBC之间的结合，我们使用lncRNA-PAGBC的完整序列进行荧光素酶报告基因测定。miR-133b和miR-511的过表达降低了PAGBC报告载体的荧光素酶活性，但不降低空载体，而其他4种miRNA未能改变荧光素酶活性。为了验证这些miRNA与lncRNA-PAGBC在内源性水平上的结合，使用MS2-RNA免疫沉淀来下拉与lncRNA-PAGBC相关的内源性微RNA。PAGBC RIP在NOZ细胞中显着富集miR-133b和miR-511。总之，这些结果表明lncRNA-PAGBC可以作为miR-133b和miR-511的ceRNA起作用。

     为了找到共享miR-133b和miR-511与PAGBC调节作用的基因，Targetscan预测了数百个靶基因考虑到微阵列数据中上调的基因，SOX4和PIK3R3引起了我们的注意，根据之前的研究，它们在各种癌的肿瘤发生中起重要作用。以前的报道显示miR-511-5p的表达需要宿主基因MRC1。进行了荧光素酶测定，结果表明miR-133b和miR-511模拟物的转染分别降低了SOX4和PIK3R3报告载体的荧光素酶活性，而突变没有。

     作为ceRNA，lncRNA-PAGBC可与其靶标共享调节miRNA；因此，我们假设lncRNA-PAGBC可以调节GBC细胞中的SOX4和PIK3R3。lncRNA-PAGBC过表达在EH-GB1细胞中的mRNA和蛋白质水平上调SOX4和PIK3R3，而异位表达的lncRNA-PAGBC-mut（miR-133b）或lncRNA-PAGBC-mut（miR-511）未显着改变SOX4或PIK3R3表达。沉默NOZ细胞中的lncRNA-PAGBC在mRNA和蛋白质水平下调SOX4和PIK3R3。对于拯救实验，miR-133b和miR-511在lncRNA-PAGBC沉默的NOZ细胞中被抑制。抑制miR-133b和miR-511分别增加了SOX4和PIK3R3的表达。相反，miR-133b和miR-511的过表达抵消了由EH-GB1细胞中过表达的lncRNA-PAGBC诱导的SOX4和PIK3R3表达的相应增加。

     这些数据表明lncRNA-PAGBC分别通过竞争性结合miR-133b和miR-511在调节SOX4和PIK3R3表达中起重要作用。

     miR-133b和miR-511可强烈抑制GBC细胞的增殖，集落形成和转移能力。在以前的研究中，SOX4和PIK3R3都被证明可以促进其他癌的增殖和转移。此外，这些研究表明SOX4和PIK3R3都参与AKT/mTOR通路，这对肿瘤增殖和转移至关重要。我们假设lncRNA-PAGBC激活GBC细胞中的AKT/mTOR途径，并且这两种miRNA都是PAGBC生物学功能所必需的。Western印迹分析证明lncRNA-PAGBC敲低抑制AKT和mTOR蛋白的磷酸化，而过表达促进AKT和mTOR蛋白的磷酸化。这些数据表明lncRNA-PAGBC激活GBC细胞中的AKT/mTOR途径。接下来，进行CCK-8和transwell测定以确定miR-133b和miR-511对GBC细胞中lncRNA-PAGBC功能的影响。结果显示lncRNA-PAGBC过表达促进了增殖和转移。此外，我们抑制了lncRNA-PAGBC沉默的NOZ细胞中的miR-133b和miR-511，并且发现这些miRNA的抑制部分地抵消了由lncRNA-PAGBC敲低诱导的增殖和转移的损害。相反，miR-133b和miR-511的过表达部分抵消了由lncRNA-PAGBC过表达诱导的增殖和转移的增加。此外，miR-133b和miR-511的过表达部分逆转了由lncRNA-PAGBC过表达诱导的AKT/mTOR途径的激活。总之，这些数据表明，与miR-133b和miR-511的相互作用对于lncRNA-PAGBC在GBC细胞中促进恶性和激活AKT/mTOR途径是必需的。

     最近的几项研究发现，许多lncRNA通过与蛋白质的相互作用参与分子调控途径。为了确定lncRNA-PAGBC是否以这种方式起作用，进行RNA pull-down测定以鉴定与NOZ细胞中的lncRNA-PAGBC相关的蛋白质。切下lncRNA-PAGBC特异性条带并进行质谱分析。 Poly（A）结合蛋白，细胞质1（PABPC1）是通过质谱鉴定的主要蛋白质。此外，我们还发现Ago2被lncRNA-PAGBC富集，这进一步支持了我们之前的Ago2 RIP结果。这些结果表明lncRNA-PAGBC与PABPC1蛋白相互作用。

     最近的几项研究表明，PABPC1可以增加mRNA或长链非编码病毒RNA的稳定性。另外，lncRNA-PAGBC具有Poly（A）尾，这是通常在mRNA中发现的特征。因此，我们假设PABPC1通过稳定它来增加lncRNA-PAGBC的表达。为了验证该假设，在GBC细胞中siRNA敲低PABPC1后，进行了lncRNA-PAGBC的qRT-PCR分析。结果显示PABPC1沉默显着降低了lncRNA-PAGBC的表达水平。为了检查PABPC1是否调节lncRNA-PAGBC的稳定性，我们用放线抑制剂放线菌素D处理NOZ细胞以阻断新的RNA合成。然后我们在12小时内测量了lncRNA-PAGBC和GAPDH的表达，并发现PABPC1敲低显着且快速地降低了lncRNA-PAGBC表达（图7F）。总之，这些数据表明PABPC1增加了lncRNA-PAGBC的稳定性并通过与lncRNA-PAGBC结合来调节其表达。此外，为了解PABPC1对lncRNA-PAGBC功能的作用，我们敲除了PABPC1在NOZ细胞中的表达。结果表明，PABPC1的沉默导致体外增殖和转移的抑制，Akt/mTOR途径的失活，miR-133b和miR-511的上调以及其靶基因的下调。在拯救实验中，lncRNA-PAGBC的过表达可以抵消PABPC1沉默的影响（图EV4）。

     胆囊癌预后极差。我们对GBC中lncRNA的表达谱进行了表征，发现lncRNA-PAGBC可作为不良预后标记物应用，并作为GBC中的致癌lncRNA。证明PABPC1与lncRNA-PAGBC相互作用并进一步稳定。更重要的是，lncRNA-PAGBC可通过作用于海绵来促进肿瘤发生并激活GBC细胞中的AKT/mTOR途径，从而损害miR-133b依赖性SOX4和miR-511依赖性PIK3R3下调（图EV5）。我们的研究结果为GBC的分子发病机制提供了新的见解，并提供了针对这种恶性肿瘤的潜在新型lncRNA指导的诊断和治疗靶点。

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