Taurine up‐regulated gene 1 functions as a master regulator to coordinate glycolysis and metastasis in hepatocellular carcinoma

牛磺酸上调基因1作为主要调节剂起作用以协调肝细胞癌中的糖酵解和转移

期刊：Hepatology；影响因子：14.079   

发表单位：台湾桃园长庚大学  

    之前微文“Advanced Science：lnc, miRNA, mRNA关系一定是ceRNA吗”介绍与lncRNA ceRNA机制相反，lncRNA可以稳定miRNA的表达抑制靶基因。本研究同样从lncRNA, miRNA, mRNA的角度阐释了肿瘤样品中lncRNA TUG1稳定miR-455-3p抑制AMPKβ2表达，而AMPKβ2的抑制促进己糖激酶2（HK2）的表达，进而调节细胞生长，转移和糖酵解。

    癌细胞显示出改变的葡萄糖代谢，其特征在于优选有氧糖酵解。然而，糖酵解代谢是否影响HCC转移的问题仍不清楚。在目前的研究中，我们发现敲低牛磺酸上调基因1（TUG1）可通过抑制miR-455-3p显著抑制细胞迁移、侵袭和糖酵解。miR-455-3p直接靶向AMP激活的蛋白激酶亚基β2（AMPKβ2）的3'非翻译区。TUG1/miR-455-3p/AMPKβ2轴通过调节己糖激酶2（HK2）调节细胞生长，转移和糖酵解。TUG1明显与HCC患者的HK2过度表达和不良预后相关。

    肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肝肿瘤之一。HCC的长期预后仍然极差，转移是导致死亡的主要根本原因。癌细胞的代谢特性不同于正常细胞的代谢特性。癌细胞表现出独特的代谢表型，例如增强的葡萄糖摄取和丙酮酸转化为乳酸。这种称为Warburg效应的现象赋予癌细胞相当大的生长优势。除了依赖于糖酵解外，癌细胞还表现出非典型的代谢特征，例如脂肪酸合成增加和谷氨酰胺代谢增加。这些差异表明，靶向代谢依赖可能是治疗癌症患者的一种有前途的选择性方法。

    使用微阵列分析，在两个HCC样品中鉴定了与癌旁组织样品相关的几种差异表达的lncRNA（倍数变化≥2.0或≤0.5;P<0.05）。微阵列数据可在GEO上公开获得，登录号为GSE101679。在这些lncRNA中，123个持续上调，279个在HCC中持续下调。此外，进行qRT-PCR以验证从微阵列分析获得的基因表达结果，证实与相应的非肿瘤对应物相比，HCC组织中TUG1的显著上调。将我们的数据中的基因表达数据与其他公开数据集联系起来（数据2，GSE14520；数据3，GSE14323；数据4，癌症基因组图谱数据集TCGA）用于表达模式的生物学解释。一致地，TUG1在来自其他数据的HCC中高度表达。如何挖掘TCGA，GEO等数据参考微文“重磅首发: TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA数据挖掘（含分析结果）”

    大多数lncRNA的确切功能尚未确定。以前的研究表明，具有相似共表达模式的基因倾向于表现出功能连贯性。这种方法可以有效地用于探索lncRNA在癌症进展中的作用。在目前的研究中，TUG1的共表达分析在公开数据集（GSE14323）中使用Pearson相关性进行，然后在排序列表中排序Pearson相关系数。将数据上载至基因组富集分析工具，并使用“Gene Set Enrichment Analysis Preranked”模块进行通路分析。结果表明上皮-间质转化显著增强并且与TUG1表达正相关。此外，细胞周期和糖酵解表型与TUG1正相关，正如使用生物信息学工具lncRNAtor所观察到的那样，清楚地表明TUG1参与了这些通路。

    与体外和体内转染载体对照的细胞相比，敲低TUG1显著抑制Hep3B和SK-Hep1细胞系的生长。使用qRT-PCR进一步证实肿瘤中的TUG1表达。之前已经报道过这些表型。另外还研究了TUG1对肝癌细胞迁移和侵袭的潜在影响。在沉默内源性TUG1的Hep3B和SK-Hep1细胞中明显抑制了迁移和侵袭能力（图1A，B）。代谢重编程是细胞转化的已知标志，但对肿瘤转移伴随的代谢变化知之甚少。为了探索TUG1对肝癌细胞代谢重编程的潜在影响，评估了葡萄糖摄取和乳酸产生。值得注意的是，TUG1的敲低降低了Hep3B细胞的葡萄糖摄取能力并导致乳酸产生减少。为了进一步验证TUG1对HCC糖酵解的影响，使用XF24细胞外通量分析仪测量细胞外酸化率。数据一致表明，敲低TUG1显著抑制Hep3B细胞中的糖酵解速率。

    已经报道了lncRNA对miRNA表达的影响。为了鉴定TUG1调节的miRNA，使用qRT-PCR在TUG1沉默的Hep3B细胞系中进行miRNA表达筛选。因此，miR-455-3p被确定为新的潜在候选者。我们的qRT-PCR结果显示在TUG1沉默的Hep3B细胞系中成熟miR-455-3p的下调。此外，miR-455的前体和初级转录物受TUG1显著调节，表明miR-455-3p在转录水平被TUG1调节。接下来，检查miR-455-3p对细胞生长，迁移，侵袭和糖酵解的影响。miR-455-3p的敲低导致迁移，侵袭，糖酵解和细胞增殖减少，类似于由TUG1抑制诱导的表型。相反，miR-455-3p的过表达导致相反的效果。

    为了探索TUG1/miR-455-3p轴的直接作用，选择miR-455-3p的特异性靶基因用于进一步研究。使用TargetScan和miRDB软件进行的搜索，AMPKβ2被鉴定为潜在的miR-455-3p靶基因。进行荧光素酶报告基因测定强烈暗示AMPKβ2是直接miR-455-3p靶标。通过产生稳定敲低AMPKβ2的Hep3B和SK-Hep1细胞，进一步检测AMPKβ2对细胞迁移和侵袭的影响。值得注意的是，AMPKβ2敲低导致细胞迁移和侵袭能力显著增强，而其过表达则产生相反的效果。

    AMPKα通过抑制各种癌症（包括HCC）中的糖酵解和肿瘤生长而起到抑制肿瘤的作用。上皮-间质转化是肿瘤相关上皮细胞获得间充质特征的过程，是转移过程中的关键步骤。评估TUG1是否有助于这些肿瘤标志物的活性，检测了p-AMPKα（Thr172）和Snail的蛋白质水平。TUG1敲低细胞中间充质标记物Snail的水平降低。TUG1敲低的Hep3B或SK-Hep1细胞中p-AMPKα（Thr172）的水平更高，但总蛋白水平不是。TUG1敲低的细胞中AMPKβ2蛋白水平增加。用miR-455-3p敲低细胞观察到类似的结果。为了确定miR-455-3p，AMPKβ2或AMPKα可能参与TUG1介导的细胞生长和迁移能力，建立了过表达miR-455-3p或沉默AMPKβ2或AMPKα1的TUG1敲低细胞。值得注意的是，TUG1敲低细胞中miR-455-3p过表达诱导细胞增殖和迁移的显著增加。敲除AMPKβ2或AMPKα逆转了TUG1敲低对细胞迁移和生长的影响，表明TUG1通过调节miR-455-3p，AMPKβ2和AMPKα发挥其致癌作用。与TUG1敲低细胞相比，TUG1和AMPKβ2敲低细胞中的蛋白质水平明显增加。

    HK2 mRNA仅在TUG1敲低细胞系中被轻微抑制，表明HK2表达在翻译水平而不是转录水平受TUG1调节。进一步研究了HK2的基本调控机制。有趣的是，HK2的表达通过TUG1或miR-455-3p敲低细胞中的蛋白酶体抑制剂MG132稳定，暗示TUG1或miR-455-3p直接通过蛋白酶体控制HK2蛋白稳定性。此外，与环己酰亚胺追踪实验中的对照（sh-luc）细胞相比，在TUG1敲低中HK2周转率是快速的。

    为了进一步确定癌细胞转移与糖酵解表型的关联，使用体外transwell侵袭测定建立高度转移的Hep3B衍生的细胞群（称为Hep3B-TW）。Hep3B-TW的侵袭能力高于Hep3B。如所预期的，相对于Hep3B细胞，Hep3B-TW中miR-455-3p表达增加。相对于亲本Hep3B细胞，p-AMPKα（Thr172）和AMPKβ2蛋白水平较低。此外，与Hep3B细胞相比，Hep3B-TW细胞中的糖酵解速率升高。

    为了确定HK2，p-mTOR（Ser2448），p-AMPKα（Thr172），AMPK2和miR-455-3p表达水平是否与肿瘤进展相关，分别在HCC标本中进行蛋白质印迹和qRT-PCR测量蛋白质和RNA水平。相对于相应的非肿瘤对应物，HK2在HCC组织中高度表达，而在HCC中p-AMPKα（Thr172）和AMPKβ2水平下调。在HCC中MiR-455-3p表达升高。显示增强的HK2和p-mTOR（Ser2448）表达并伴随降低的p-AMPKα（Thr172）。Spearman相关系数分析的结果证实TUG1与miR-455-3p和HK2显著正相关。考虑到HCC肿瘤中TUG1和HK2之间的正相关性。临床研究验证了TUG1/miR-455-3p/AMPKβ2/HK2在体内和体外的相关性，明确支持TUG1，miR-455-3p，AMPKβ2和HK2在肝细胞瘤中的关键病理学作用。

    总之，我们已经取得了概念上的进展，支持改变糖酵解代谢有助于转移表型的理论。TUG1通过上调EED表达降低p21表达，并导致p21-E2F1相互作用减少和miR-455-3p表达增强。因此，miR-455-3p抑制AMPKβ2表达并促进HK2和Snail表达增加。我们已经鉴定了一种通路，其互连TUG1，miR-455-3p，AMPKβ2，AMPKα/mTOR，Snail和HK2，其调节肝细胞瘤的糖酵解，运动和侵袭。我们的研究提供了靶向TUG1和HK2用于治疗HCC的潜在治疗策略。

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