Functional Role of A Novel Long Noncoding RNA TTN-AS1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma Progression and Metastasis

Functional Role of A Novel Long Noncoding RNA TTN-AS1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma Progression and Metastasis

新型长非编码RNA TTN-AS1在食管鳞状细胞癌进展和转移中的功能作用

期刊：Clinical Cancer Research；影响因子：10.199

发表单位：中国药科大学   

    芯片筛选食管癌组织mRNA, lncRNA, miRNA，研究lncRNA ceRNA机制。发现，lncRNA-TTN-AS1通过竞争性结合miR-133b促进转录因子Snail1的表达，促进上皮-间质转化（EMT）过程。

    实验设计：为了发现RNAs彼此联系的新调节通路，使用多个微阵列和多种生物信息学平台分析来自ESCC和癌旁样本的lncRNA-miRNA-mRNA的转录组。通过体内和体外获得和丧失功能测定进一步研究新lncRNA-TTN-AS1的功能作用和机制。由lncRNA-TTN-AS1，miR-133b和FSCN1组成的ESCC生物标志物组通过qRT-PCR和使用来自148名患者的样品的原位杂交验证。

    结果：LncRNA-TN-AS1作为致癌基因，在ESCC组织和细胞系中高表达，促进ESCC细胞增殖和转移。在机理上，lncRNA-TTN-AS1通过竞争性结合miR-133b促进转录因子Snail1的表达，导致上皮-间质转化（EMT）级联。此外，lncRNA-TTN-AS1还通过海绵状miR-133b和mRNA稳定蛋白HuR的上调诱导FSCN1表达，这进一步促进ESCC侵袭级联反应。我们还发现并验证了临床适用的ESCC生物标志物组，其由lncRNA-TTN-AS1，miR-133b和FSCN1组成，其与总体存活显著相关并为ESCC患者提供额外的预后证据。

    食管癌在世界范围内肿瘤相关性死亡疾病中排名第六位。尽管多模式疗法改善了EC的治疗和预后，但总的5年生存率仍然很差。随着高通量分析的进步，已经鉴定出与肿瘤增加相关的非编码RNA。特别地，已经证实多种与EC相关的lncRNA通过各种生物过程发挥多种功能。例如，HNF1A-AS1诱导H19表达并调节染色质和核小体组装，导致基因印记。HOX转录物反义RNA（HOTAIR）通过在启动子区诱导组蛋白H3K27甲基化来抑制WIF-1的表达。已发现许多与EC相关的lncRNA，但ESCC中大多数lncRNA的精确分子机制仍未完全了解。

    为了理解RNA可以相互串联的调节通路，通过多个微阵列检测来自7个ESCC患者（补充表S1）的ESCC组织和癌旁组织中的lncRNA，mRNA和miRNA的表达谱。数据编号GSE97051可获得。为了验证我们的微阵列数据，通过qRT-PCR检查了14种具有显著不同表达的转录物（补充图S1）。结果显示11个转录物的水平与微阵列数据一致。此外，使用共表达网络（图1D）和多种生物信息学工具（图1E）筛选潜在的lncRNA。最后，具有显著相关性的miRNA-lncRNA对的数量缩小至3。微阵列数据显示ENST00000589434在ESCC组织中显著下调，并且ENST00000589434和hsa-miR-133b之间的相关性得分最高。因此，我们重点研究了lncRNA-TTN-AS1（ENST00000589434）在ESCC中的作用和机制。

    BLAST搜索没有发现同源蛋白质序列；lncRNA-TTN-AS1的所有外显子的PhyloCSF值小于零，并且它们的序列保守性较低，这进一步表明它不可能编码任何蛋白质。在线生物信息学分析（cpc）也证实lncRNA-TTN-AS1没有编码能力，即lncRNA-TTN-AS1没有编码能力。

    众所周知，作为竞争性内源RNA（ceRNA）的非编码RNA与miRNA结合并保护其靶RNA免受抑制或降解。在人ESCC中发现的miR-133b的下调促使我们看到lncRNA-TTN-AS1是否与ESCC组织中的miR-133b呈负相关。如所预期的，在组群1中的ESCC组织中lncRNA-TTN-AS1强烈上调（P=0.000，补充图S3A。）。相反，miR-133b表达在ESCC组织中显著下调（P=0.000）。此外，与正常食管上皮细胞（HEEC）细胞相比，ESCC细胞系中lncRNA-TTN-AS1表达显著更高，而miR-133b水平更低。一致地，在ESCC组织中（r=-0.8704，P<0.001，补充图S3E）和细胞系中（r=-0.8500，P<0.001，补充图.S3F）lncRNA-TTN-AS1和miR-133b之间存在强烈的负相关。

    接下来，我们进行荧光素酶报告分析和RNA pull-down分析，以测试lncRNA-TTN-AS1和miR-133b之间的直接结合。数据表明lncRNA-TTN-AS1是靶向lncRNA的真正的miR-133b。LncRNA-TTN-AS1主要存在于ESCC细胞系的细胞质中，这表明lncRNA-TTN-AS1可通过Ago2依赖性RNAi通路与miR-133b结合。如所预期的，RIP测定显示抗-Ago2抗体沉淀的lncRNA-TTN-AS1和miR-133b的水平显著增加，与IgG相比富集2~3倍。同时，Ago2的内源性lncRNA-TTN-AS1下调特异性地在miR-133b的过表达时富集。这些数据证实lncRNA-TTN-AS1以Ago2依赖性方式与细胞质中的miR-133b结合。为了进一步证实lncRNA-TTN-AS1为ceRNA，我们比较了lncRNA-TTN-AS1和miR-133b的丰度。在TE-13细胞中，lncRNA-TTN-AS1（每个细胞约1.45个拷贝）的精确拷贝数高于miR-133b（每个细胞约0.37个拷贝）。此外，lncRNA-TTN-AS1过表达降低了miR-133b的拷贝数。总之，这些数据表明lncRNA-TTN-AS1与作为ceRNA的miR-133b物理相互作用。

    为了剖析lncRNA-TTN-AS1在ESCC进展中的作用，使用ESCC细胞系进行获得和功能丧失测定。lncRNA-TTN-AS1的异位表达诱导细胞增殖和集落形成，而miR-133b的过表达消除了这种增加。在体内测定中，与阴性对照相比，具有lncRNA-TTN-AS1过表达克隆的异种移植物中的肿瘤生长增加，而miR-133b的异位表达消除了lncRNA-TTN-AS1诱导的肿瘤生长。另外，lncRNA-TTN-AS1的过表达增加了增殖（Ki67+）癌细胞的比例。

    为了进一步研究lncRNA-TTN-AS1和miR133b对细胞增殖的影响，进行了凋亡相关的实验。过表达lncRNA-TTN-AS1的ESCC细胞具有显著减少的G1群体和显著增加的S期，并且miR-133b的异位表达逆转了上述现象。总之，这些结果表明lncRNA-TTN-AS1通过失活凋亡相关的信号传导通路诱导细胞增殖并促进细胞周期进展。

    由于miR-133b靶向Snail1和lncRNA-TTN-AS1与Snail1共享miR-133b反应元件，我们推断lncRNA-TTN-AS1可诱导EMT转录因子Snail1并促进ESCC细胞的侵袭。我们发现lncRNA-TTN-AS1显著增加了Snail1的表达，这可以通过miR-133b的异位表达来消除。此外，双荧光素酶报告基因分析验证了lncRNA-TTN-AS1的异位表达，但不是突变体，增加了荧光素酶强度，这可以通过miR-133b的过表达来消除。另外，lncRNA-TTN-AS1与Snail1 mRNA水平正相关。这些数据说明lncRNA-TTN-AS1通过竞争性结合miR-133b调节Snail1，这可能进一步促进ESCC转移。

    为了进一步检查lncRNA-TTN-AS1对ESCC细胞转移和EMT级联的影响，进行细胞迁移和侵袭以及伤口愈合测定。lncRNA-TTN-AS1的异位表达促进细胞迁移，细胞侵袭和刮擦闭合率，而miR-133b的过表达减弱了lncRNA-TTN-AS1诱导的细胞转移。同时，lncRNA-TTN-AS1显著诱导间充质标志物N-钙粘蛋白和波形蛋白，并降低上皮标志物E-钙粘蛋白和ZO-1的表达，这些表达由miR-133b的异位表达拯救。此外，lncRNA-TTN-AS1消除了由miR-133b诱导的Snail1和EMT的抑制。总之，我们的数据证明lncRNA-TTN-AS1通过miR-133b的竞争性结合在激活EMT中起关键作用。

    为了确定lncRNA-TTN-AS1和EMT标志物之间的相关性，我们检测了具有不同lncRNA-TTN-AS1表达的四种ESCC细胞系中EMT标志物的水平。在lncRNA-TTN-AS1高表达细胞中观察到高水平的Snail1，N-钙粘蛋白和波形蛋白以及低水平的E-钙粘蛋白。一致地，lncRNA-TTN-AS1转录物与ESCC样品中的E-钙粘蛋白mRNA水平负相关。

    为了评估lncRNA-TTN-AS1对体内肿瘤转移的影响，然后我们将指定的ESCC细胞静脉内注射到裸鼠中以建立肿瘤转移模型。lncRNA-TTN-AS1的过表达增强了肝脏和肺的荧光强度，通过miR-133b的异位表达减弱。类似地，肝脏和肺中的转移性肿瘤细胞随着lncRNA-TTN-AS1的异位表达显著增加，而miR-133b消除了增加。以上所有数据证实lncRNA-TTN-AS1促进ESCC转移。

    MiR-133b靶向并调节与ESCC细胞转移相关的FSCN1（肌动蛋白结合蛋白，Fascinhomolog1）表达。由于lncRNA-TTN-AS1与FSCN1具有相同的miR-133b结合位点，我们质疑lncRNA-TTN-AS1是否可以通过miR-133b调节FSCN1并进一步增强ESCC细胞中的EMT信号传导通路。一致地，lncRNA-TTN-AS1的过表达增强了FSCN1水平，而miR-133b的异位表达消除了增加。lncRNA-TTN-AS1的过表达增加了pmirGLO-FSCN1的荧光素酶强度。miR-133b的异位表达克服了这种上调。

    lncRNA的亚细胞定位决定了其潜在的机制。众所周知，细胞质lncRNA通过与RNA结合蛋白（RBP）的相互作用来调节基因转录。由于miR-133b靶向并调节HuR mRNA，相反，HuR还抑制miR-133b从linc-MD1释放。因此，我们推断lncRNA-TTN-AS1也可通过其海绵活性促进HuR，其进一步诱导FSCN1 mRNA表达和稳定性。如所预期的，首先，miR-133b的异位表达降低了HuR水平，相反，HuR的消耗增加了TE13细胞中的miR-133b水平。

    为了研究lncRNA-TTN-AS1/miR-133b/FSCN1水平与ESCC进展之间的关联，我们通过qRT-PCR和原位测量了组1和组2中lncRNA-TTN-AS1/miR-133b/FSCN1的表达水平。分别进行杂交（ISH）测定。结果显示，与癌旁组织相比，lncRNA-TTN-AS1和FSCN1主要在ESCC组织中表达，而miR-133b在正常组织中表达更丰富。

    Kaplan-Meier和对数秩检验分析证实，lncRNA-TTN-AS1/FSCN1高表达或miR-133b低表达的患者与总生存期降低（OS）呈正相关。此外，具有lncRNA-TTN-AS1-high/miR-133b-low的ESCC患者的总体存活率短于其他三组中的患者。

    我们的研究表明，lncRNA-TTN-AS1促进ESCC细胞增殖和侵袭-转移，诱导与miR-133b的竞争性结合，导致Snail1，HuR和FSCN1的上调。此外，由lncRNA-TTN-AS1诱导的HuR增加β-连环蛋白表达，通过与HuR的相互作用增强FSCN1mRNA表达和稳定性。lncRNA-TTN-AS1对ESCC进展的多效性为我们对ESCC癌变的理解提供了重要的新见解。

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