Recently Evolved Tumor Suppressor Transcript TP73-AS1 Functions as Sponge of Human-Specific miR-941

Recently Evolved Tumor Suppressor Transcript TP73-AS1 Functions as Sponge of Human-Specific miR-941

最近进化的肿瘤抑制因子转录本TP73-AS1作为人特异性miR-941的海绵起作用

期刊：Molecular Biologyand Evolution；影响因子：10.217 

发表单位：中国药科大学  

    已知miRNA，如何寻找结合的miRNA海绵lncRNA，本研究确定miR-941，使用targetscan软件扫描可以与之结合的lncRNA，或circRNA。发现TP73-AS1有9个结合位点，从多物种进化的角度讨论了，TP73-AS1与miR-941进化保守性，结合保守性。详细论述了TP73-AS1与miR-941结合位点。对于寻找ceRNA中miRNA和lncRNA很有参考意义。

    miRNA海绵是转录后基因调控的重要组成部分。然而，仅鉴定了有限数量的miRNA海绵。在这里，我们显示最近进化的非编码肿瘤抑制转录本，TP73基因的反义RNA（TP73-AS1），作为人特异性miRNA miR-941的天然海绵。我们发现9个异常高亲和力的miR-941结合位点聚集在TP73-AS1的1kb区域内，形成miR-941海绵区域。我们基于大量转录组数据分析，伤口愈合测定和在细胞系中进行的Argonaute蛋白免疫沉淀实验进一步确认TP73-AS1作为有效的miR-941海绵起作用。

    miRNA是广泛认可的转录后调节因子，可以微调大多数哺乳动物蛋白编码基因（PCG）和长链非编码RNA（lncRNA）的表达。miRNA的主要功能是将RNA诱导的沉默复合物（RISC）引导至含有转录本的互补结合位点。虽然已经描述了含有单个miRNA结合位点的miRNA海绵，但是大多数有效的miRNA海绵转录本含有多个高亲和力miRNA结合位点并且以高水平表达。目前，分别在人和小鼠中记录了具有实验证据的64和117个miRNA海绵转录本。实例包括最近进化的假基因PTENP1，lncRNA slinc-RoR和灵长类特异性的lncND，以及脊椎动物物种中保守的转录本：环状RNA（circRNA）CDR1as和sryRNA。

    为了鉴定潜在的miR-941-海绵基因，我们筛选了人非编码转录本（NCT），包括36,687个线性转录本和36,019个circRNA。为此，我们使用来自本研究生成的四个人类前额皮质（PFC）样本的Ribo-minus测序数据编辑已知的线性NCT并鉴定潜在的circRNA，并重新分析54个公布的Ribo-minus测序数据集。我们使用TargetScan鉴定了存在于NCT内的miR-941结合位点，没有位点保守要求。2,050个（2.8％）含有一个结合位点。值得注意的是，注释为TP73基因的反义RNA的线性转录本（TP73-AS1，也称为KIAA0495或PDAM）含有9个miR-941结合位点（图1a，补充表S2，在线补充材料）。

    在TP73-AS1中，9个miR-941结合位点不是均匀分布的，而是聚集在~900-nt长区域内，形成miR-941海绵区域（图1b）。9个结合位点中的每一个包含与miR-941的5'末端2-10位的完全互补的9-nt长区域（图1c）。总之，这些序列特征导致TP73-AS1与其他miR-941靶基因相比具有显著更高的结合亲和力（Wilcoxon秩和检验，P<0.01，补充图S3），进一步表明TP73-AS1转录本代表天然存在的miR-941海绵。

    TP73-AS1转录本中miR-941结合位点的出现先于miR-941的进化。含有直接或反向构型的miR-941结合位点的串联重复序列（miR-941结合位点的反向互补）存在于人，猿和OWM中TP73-AS1的特定区域内（图2a）。OWM，如猕猴和狒狒，分别有一个和两个miR-941结合位点，猩猩有六个，大猩猩有12个，黑猩猩有16个，人类有9个。人类和猿谱系miR-941结合位点数的增加可以追溯到在OWM中含有单个miR-941结合位点的71-nt长序列的串联扩增（图2a和b）。

    值得注意的是，包含所有miR-941结合位点的TP73-AS1的“海绵”部分的1-kb长基因组区域仅在人类中显示出增加的序列保守性。具体而言，对区域内和侧翼1-kb长序列中的常见单核苷酸多态性（SNP）的分析显示人类中SNP发生的明显减少，但在黑猩猩和猕猴中没有（图2c）。

    在人类基因组中，TP73-AS1注释为位于chr1的p36.32区域中的两个PCG，TP73和CCDC27之间的6,409-nt-lncRNA（图3a）。TP73-AS1与尾部到尾部配置的TP73重叠，重叠长度为216nt。虽然TP73和CCDC27在哺乳动物中都是保守的，但人类TP73-AS1的序列直向同源物可以在猿，OWM和新世界猴（NWMs）中鉴定，但在小鼠，大鼠，牛和鸡中不能鉴定（图3a）。这意味着TP73-AS1的转录仅限于人，猿和OWM。尽管TP73-AS1是最近进化的lncRNA，但它在63个人组织中普遍存在且高度表达。此外，TP73-AS1表达平均比其邻近基因TP73和CCDC27的表达高50倍。

    由于miRNA的抑制功能，其表达通常与线性海绵转录本的表达呈负相关。为了评估miR-941和TP73-AS1的情况，我们进行了细胞系转染和免疫沉淀实验，并分析了现有的转录组数据。TP73-AS1是miR-941的预测靶标之一。为了验证这一点，我们用miR-941双链体或模拟对照一式三份转染293T细胞系，并使用RNA-seq评估TP73-AS1表达。与模拟物相比，miR-941双链体转染后24小时TP73-AS1表达显著降低。因此，在各种人细胞系中，miR-941一致地负调节TP73-AS1的表达。类似地，表达miR-941和TP73-AS1转录本在11种类型的人免疫细胞中反向相关（Pearson相关性r=-0.74，P<0.01）。

    为了评估TP73-AS1是否与RISC中的miR-941物理相互作用，我们在用miR-941双链体转染的293T细胞系中进行了AGO2免疫沉淀（AGO2-IP）实验。基于微阵列的IP产物分析表明，与TP73-AS1特异性的所有三种微阵列探针的IgG对照相比，AGO2复合物中TP73-AS1的浓度一致，表明TP73-AS1和miR-941的直接相互作用。RISC。总之，上述结果强烈表明TP73-AS1是miR-941的真实靶标。

    miR-941的过表达显示出对肝细胞，结肠直肠癌和胃癌细胞中细胞迁移的显著抑制。我们对基于实验验证的miR-941靶标的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的分析同样挑选出一个网络模块，该网络模块使用CoCiter显著富集与“细胞迁移”术语相关的基因。为了评估TP73-AS1是否可以阻断miR-941对细胞迁移的抑制，我们进行了miR-941和TP73-AS1过表达实验，随后在293T细胞中进行了伤口愈合测定。与先前的研究一致，用携带含有7种miR-941前体的人miR-941簇区的载体瞬时转染293T细胞可重复地抑制细胞迁移。相反，用miR-941载体和携带含有9个miR-941结合位点（TP73-AS1海绵区域）的人TP73-AS1区域的载体的平行转染消除了抑制，并导致加速的细胞迁移。

    以前的研究表明TP73-AS1可作为肿瘤抑制因子起作用，而miR-941优先在增殖和肿瘤细胞中表达。我们发现TP73-AS1和miR-941在15种健康人体组织和8种人类癌细胞系中具有惊人相反的表达模式：miR-941在肿瘤中表达高出约8倍，TP73-AS1在正常组织中表达高出4倍。在健康组织中。类似地，我们发现使用包含63个健康组织和675个癌细胞系的RNA-seq数据集在健康组织中TP73-AS1的表达升高，以及调查87个健康组织和287个原发性肿瘤的微阵列数据集。

    在许多癌症中观察到TP73-AS1的表达抑制，包括黑素瘤，可能是由于启动子区域的DNA高甲基化。我们的结果表明，这可能导致miR-941上调。为了测试这一点，我们检测了miR-941及其在正常黑素细胞向黑素瘤转化过程中的靶基因表达变化。我们发现，虽然TP73-AS1下降，但miR-941的表达确实从黑素细胞增加到黑素细胞的2倍以上。因此，miR-941靶基因的表达在黑素瘤中被显著抑制。此外，TP73-AS1表达与82个原发性和转移性黑素瘤细胞系中miR-941靶基因的表达正相关。值得注意的是，在miR-941靶标中，TSG显示出更强的相关性，包括已知的TSGTP73，TP73-AS1的反义基因。

    我们对来自9种不同组织类型的大量MCTP癌症样品的分析产生了类似的结果。因此，影响多个TSG表达水平的miR-941和TP73-AS1表达之间的强关联可能表明转录本在肿瘤发生和肿瘤抑制中的作用的重要性。

    总之，这些观察结果使我们能够提出TP73-AS1和miR-941进化的可能情景。TP73-AS1在大约4千万年前出现后表达的快速上升可能是由于其肿瘤抑制功能为表达它的个体提供了适应性益处。反过来，miR-941在过去600万年出现后表达的快速上升可能是由TP73-AS1作为miR-941海绵起作用的，因此减少了新调节剂的潜在有害作用。然而，miR-941似乎充当TP73-AS1拮抗剂并且可以代表有效的肿瘤发生因子。miR-941的这种明显有害的功能必须被其提供给其携带者的适应性优势所抵消，这可能与发育期间的细胞迁移调节有关。如果这些观点是正确的，进化新型TP73-AS1和miR-941转录本的调节平衡可能在人体组织的肿瘤发生中起重要作用。此外，在基于除人类以外的物种的模型系统中，这种角色将被遗漏。

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