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Non-coding RNAs participate in the regulatory network of CLDN4 via ceRNA mediated miRNA evasion
Non-coding RNAs participate in the regulatory network of CLDN4 via ceRNA mediated miRNA evasion
非编码RNA通过ceRNA介导的miRNA逃避参与CLDN4的调节网络
期刊：NATURE COMMUNICATIONS；影响因子：12.353
发表单位：中国医科大学附属第一医院
导 读
大多老师通过芯片或者测序获得了差异表达的lncRNA，此时想研究其ceRNA机制。一般逻辑是找到差异lncRNA，接下来预测结合的miRNA，再预测miRNA结合的靶基因。可是或许会发现一个问题，这个lncRNA在本研究中确是发挥重要作用吗?如果验证了差异lnc，也可能找不到合适的miRNA及有效的靶基因。lncRNA与miRNA是调节分子，其作用依赖于靶基因的功能。正常找分子的思路应该是先找到有效的靶基因（该基因在此过程中发挥重要作用，他的变化，会影响整个过程），而后预测可以结合并抑制他的miRNA，进而倒推哪些lncRNA可以结合miRNA。本研究是一个很好的例子。
摘 要
本研究，我们发现了一种调节胃癌中Claudin-4的网络。我们观察到Claudin-4在胃癌中上调并且与预后不良有关。Claudin-4可增强AGS，HGC-27和SGC-7901细胞的增殖，侵袭和EMT，这可被miR-596和miR-3620-3p逆转。此外，lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以作为竞争性内源RNA来影响Claudin-4的功能。我们的结果表明，非编码RNA在Claudin-4的调控网络中发挥重要作用。
介 绍
胃癌（GC）是最常见的癌症之一，在世界范围内死亡率很高。转移是许多复杂过程的最终结果，是临床实践中的一项重大挑战。越来越多的证据揭示了miRNA在癌基因和肿瘤抑制基因的转录后调控中不可或缺的功能，从而调节肿瘤细胞的生物学行为，如侵袭，转移，增殖和凋亡。有趣的是，最近的一些研究报告了一种全新的lncRNAs调控通路，其中lncRNA可以作为竞争性内源RNA（ceRNA）发挥作用，并通过竞争性结合其常见的miRNA与mRNA发生串扰。
结 果
1
CLDN4被鉴定为miR-596和miR-3620-3p的靶标
为了鉴定GC中mRNA和ncRNA的调节网络，使用Human LncRNA+mRNA Arrayv3.0以及miRCURY LNATM microRNA Array通过微阵列分析六对GC组织和癌旁组织。总共发现235个miRNA在GC和非肿瘤邻近组织之间差异表达，包括173个上调，62个下调超过2倍。共发现4329个lncRNA显著差异表达，其中1974个上调，2355个下调。总共鉴定了3369个差异表达的mRNA，其中1816个上调，1553个下调超过2倍。应用分层聚类以显示miRNA，lncRNA和mRNA的表达模式（图1a）。根据通路分析结果，我们选择了四种与癌症发展相关的经典通路：“细胞粘附”，“癌症中的通路”，“紧密连接”和“细胞周期”。结合lncRNA和miRNA微阵列结果，在选择这四种通路中的经典基因时进行mRNA-ceRNA分析（图1b）。
在“紧密连接”通路的mRNA-ceRNA分析结果中，与癌症发展密切相关的CLDN4引起了我们的注意。最初，TargetScan（7.1版）结果显示CLDN4含有预测的miR-596，miR-3620-3p和miR-4292靶向位点（图1c）。我们证实了miR-596，miR-3620-3p和miR-4292在转录（图1d）和翻译（图1e）水平上可以对CLDN4表达产生负调控。为了测试这些miRNA对基因表达的影响，我们将荧光素酶报告质粒psiCHECK2-CLDN4转染到GC细胞中。过表达miR-596和miR-3620-3p，但不是miR-4292，miR-596-mut，miR-3620-3p-mut，miR-4292-mut或miRNA阴性对照（miR-NC），降低了psiCHECK2-CLDN4的荧光素酶活性。证明CLDN4是miR-596和miR-3620-3p的靶基因。
2
CLDN4的体外生物学功能
为了测试CLDN4的生物学功能并进一步验证其与miR-596和miR-3620-3p的结合，我们在SGC-7901，AGS和HGC-27细胞中稳定过表达CLDN4。通过miR-596或miR-3620-3p的异位过表达，可以在转录和翻译水平上克服由稳定转染引起的CLDN4上调。通过进行细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测，我们发现与含有空载体pEX-2的平行稳定细胞系相比，CLDN4过表达可显著提高SGC-7901，AGS和HGC-27细胞的增殖能力（pEX2-NC细胞）。当转染miR-596或miR-3620-3p而非miR-596-mut或miR-3620-3p-mut时，可以消除这种增加。CLDN4过表达可以显著提高GC细胞的侵袭能力，当转染miR-596或miR-3620-3p时，这种增加可以再次部分消除。CCK-8测定显示CLDN4敲低细胞的增殖明显慢于用乱序shRNA转染的平行稳定细胞系。与LV3-sh-NC细胞相比，LV3-sh-CLDN4细胞也显示出减弱的侵袭能力。通过抑制miR-596或miR-3620-3p可以在很大程度上挽救由敲除CLDN4引起的增殖能力和侵袭能力的降低。
我们注意到CLDN4对细胞周期分布或细胞凋亡没有明显影响。令我们惊讶的是，miR-596或miR-3620-3p可以促进细胞凋亡，这表明miRNA的其他靶基因可能有助于这一有趣的结果。然后，为了评估这两种miRNA对细胞增殖和侵袭的影响是否主要依赖于CLDN4，我们将两种miRNA转染到CLDN4敲低细胞中。当CLDN4被敲低时，两种miRNA对细胞增殖和转移几乎没有影响。
我们看到，与pEX2-NC细胞相比，CLDN4的过表达可以降低E-钙粘蛋白和细胞角蛋白的表达，并增强N-钙粘蛋白，β-连环蛋白，Twist1，ZEB-2和MMP9的表达。正如预期的那样，miR-596和miR-3620-3p可以部分消除这些影响。
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CLDN4和miRNA在GC组织中的表达
为了进一步研究CLDN4在人类GC中的作用，我们在104对GC组织和癌旁组织中进行了深度验证。GC组织中CLDN4的转录水平显著更高。对这104名患者使用Kaplan-Meier分析和对数秩检验，我们发现较高的CLDN4表达水平与总体存活率降低显著相关。此外，Cox多变量分析的结果显示，较高的CLDN4表达是GC预后不良的独立预测因子。由于CLDN4已被证明是miR-596和miR-3620-3p的靶基因，我们还检测了这些miRNA在相同组织中的表达。miR-596和miR-3620-3p的表达水平在GC组织中均显著较低。这些数据支持GC组织中高CLDN4表达与较差的存活相关并且与miR-596和miR-3620-3p的表达负相关。
4
LncRNA可通过直接结合与miRNA串扰
为了鉴定可能与miR-596或miR-3620-3p相互作用并充当ceRNA的lncRNA，我们进行了关注前面提到的“紧密连接”网络的实验。在14种候选lncRNA中，lncRNA-KRTAP5-AS1在响应miR-596的过表达时呈现最明显的下调。同时，lncRNA-TUBB2A和lncRNA-KRTAP5-AS1的表达在miR-3620-3p过表达后降低最多。为了测试这些调节相互作用的特异性，我们对6种胃癌细胞系进行了RNA测序（过表达miR-596的SGC-7901细胞，过表达miR-3620-3p，miRNA阴性对照，过表达lncRNA-KRTAP5-AS1，过表达lncRNA-TUBB2A，或lncRNA阴性对照）。在过表达miR-596的细胞中，CLDN4的表达（FPKM的倍数变化=0.125）和lncRNA-KRTAP5-AS1（FPKM的倍数变化=0.760）被下调。此外，CLDN4的表达（FPKM的倍数变化=0.543），lncRNA-TUBB2A（FPKM的倍数变化=0.854）和lncRNA-KRTAP5-AS1（FPKM的倍数变化=0.280）均下调在与对照组相比过表达miR-3620-3p的细胞中。有趣的是，在过表达lncRNA-KRTAP5-AS1（FPKM的倍数变化=14.168）或lncRNA-TUBB2A（FPKM的倍数变化=12.051）的细胞中发现CLDN4表达增加。
LncRNA-KRTAP5-AS1位于11号染色体上，长度为2554个核苷酸，具有5个预测的miR-3620-3p靶向位点和5个预测的miR-596靶向位点。LncRNA-TUBB2A位于染色体6上，长度为1052个核苷酸，具有5个预测的miR-3620-3p靶向位点。我们发现lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A通过ISH呈现与CLDN4和miRNA相同的细胞质定位。荧光素酶实验显示miR-596和miR-3620-3p数据显示lncRNA-KRTAP5-AS1可以结合miR-596和miR-3620-3p。同时，lncRNA-TUBB2A可以结合miR-3620-3p。
5
lncRNA充当ceRNA以在体外调节细胞功能
为了测试这两种lncRNA的生物学功能，我们在GC癌细胞中进行了功能获得和功能丧失研究。我们在SGC-7901，AGS和HGC-27细胞中稳定过表达或敲低了lncRNA-KRTAP5-AS1。通过CCK-8测定法测量，LncRNA-KRTAP5-AS1过表达导致增殖能力增加。毫不奇怪，miR-596和miR-3620-3p可以消除由lncRNA-KRTAP5-AS1引起的两种生物学功能。相反，内源性lncRNA-KRTAP5-AS1表达的敲低显著降低了AGS细胞的增殖能力和侵袭能力。如所预期的，miR-596或miR-3620-3p的抑制可以再次降低这些效应。
进行类似的实验以通过在SGC-7901，AGS和HGC-27细胞中的稳定过表达和抑制来测试lncRNA-TUBB2A的生物学功能。简而言之，通过CCK-8和transwell实验，发现lncRNA-TUBB2A过表达增加了GC细胞的增殖能力和侵袭能力，miR-3620-3p可以部分消除这种作用。相反，抑制miR-3620-3p可以挽救由lncRNA-TUBB2A敲低引起的增殖能力和侵袭能力的降低。
miR-596和miR-3620-3p可以消除CLDN4促进体外细胞增殖和侵袭的能力，并且CLDN4细胞中lncRNA-KRTAP5-AS1或lncRNA-TUBB2A的过表达显著进一步提高了这些能力。随后，测量这两种lncRNA的EMT诱导效应。在lncRNA过表达后，上调标志物（E-钙粘蛋白，细胞角蛋白）的下调和由CLDN4诱导的间充质标志物和入侵相关标志物（N-钙粘蛋白，ZEB-2，MMP9）的上调被夸大。总之，我们发现通过作为ceRNA调节CLDN4表达，lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以促进细胞增殖，侵袭和EMT。LncRNA-KRTAP5-AS1似乎充当miR-596和miR-3620-3p的ceRNA，而lncRNA-TUBB2A充当miR-3620-3p的ceRNA。
6
非编码RNA在体内调节CLDN4的功能
为了评估这些基因在体内的生物学功能，将不同的SGC-7901或HGC-27细胞皮下或静脉内注射到裸鼠中。总共有六组：第1组（pEX2-NC）注射pEX2-NC细胞;第2组（CLDN4）注射过量表达CLDN4的细胞;第3组（miR-596+CLDN4）注射用miR-596模拟物转染的过表达CLDN4的细胞;第4组（miR-3620-3p+CLDN4）注射用miR-3620-3p模拟物转染的CLDN4过表达细胞;第5组（lncRNA-KRTAP5-AS1+CLDN4）注射用lncRNA-KRTAP5-AS1转染的CLDN4过表达细胞;注射用IncRNA-TUBB2A转染的CLDN4过表达细胞和第6组（lncRNA-TUBB2A+CLDN4）。我们发现CLDN4组肿瘤肿块明显大于pEX2-NC组，miR-596和miR-3620-3p可部分减少CLDN4引起的生长趋势。此外，lncRNA过表达组中的肿瘤体积大于CLDN4过表达组中的肿瘤体积。
讨 论
在本研究中，我们发现CLDN4是miR-596和miR-3620-3p的共同靶标，可以在体外和体内显著增强GC细胞的增殖和侵袭。在外源引入miR-596和miR-3620-3p后，CLDN4的这些作用降低。我们还观察到CLDN4，其表达与miR-596和miR-3620-3p的表达呈负相关，在GC组织中上调，并且与GC患者的不良存活显著相关。与上述miRNA对CLDN4的抑制作用相反，我们的结果显示外源性引入lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以提高CLDN4对增殖和侵袭的作用。所有这些结果促使我们建议存在一个值得注意的调控网络，其中miRNA和lncRNA相互作用以共同调节CLDN4的表达模式和功能（图10）。
有报道LncRNA-ARSR可以充当miR-34和miR-449的ceRNA以促进AXL和c-MET表达，从而促进肾细胞癌中的舒尼替尼抗性。在这里，我们显示lncRNA-KRTAP5-AS1通过结合miR-596和miR-3620-3p在体外充当致癌基因，并且lncRNA-TUBB2A通过结合miR-3620-3p起作用。这表明这两种lncRNA可以作为ceRNAs。随后的研究如荧光素酶活性测定，基于Ago2的RIP和体内实验进一步证实这两种lncRNA作为ceRNA调节CLDN4。
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