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LncRNA lnc-RI regulates homologous recombination repair of DNA double-strand breaks by stabilizing RAD51 mRNA as a competitive endogenous RNA
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LncRNA lnc-RI通过稳定RAD51 mRNA作为竞争性内源RNA来调节DNA双链断裂的同源重组修复
期刊：Nucleic Acids Research；影响因子：11.561
发表单位：北京理工大学
导 读
LncRNA调节mRNA表达，无孔不入，几乎参与各种生物学过程，本研究发现电离辐射诱导DNA双链断裂修复过程中，lnc-RI竞争性结合miR-193a-3p促进RAD51表达发挥DNA双链断裂修复。
摘 要
DNA双链断裂（DSB）修复对于维持基因组稳定性至关重要。目前DSB修复机制的模型基于DNA修复蛋白的研究。我们发现电离辐射诱导的lncRNA，lnc-RI的表达与人外周血淋巴细胞中的微核频率呈负相关。抑制lnc-RI显著增加自发性DSB水平，这被证实与DSB的同源重组（HR）修复效率降低有关。我们证明了miR-193a-3p可以与lnc-RI和RAD51 mRNA结合并抑制lnc-RI和RAD51 mRNA的表达。Lnc-RI作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过与miR-193a-3p的竞争性结合和释放其对RAD51表达的抑制来稳定RAD51 mRNA。
研究背景
修复DNA损伤的异常是基因组不稳定的重要原因。 DNA双链断裂（DSBs）被认为是细胞寿命期间基因组完整性中最具灾难性的变化，通常由复制应激，基因毒性化学物质，电离辐射暴露，炎症等疾病引起。长非编码RNA（lncRNA）是一组非编码RNA转录物。LncRNAs在许多细胞生物学过程中发挥重要作用，包括细胞周期进程，细胞凋亡，发育，干细胞多能性，肌肉分化和癌发生。根据竞争性内源RNA（ceRNA）假说，特定RNA可作为miRNA海绵，以控制这些miRNA靶向的其他转录物的表达，而lncRNAs是ceRNA串扰过程的必要组成部分。我们的结果表明miR-193a-3p靶向RAD51和lnc-RI，并且lnc-RI通过与miR-193a-3p竞争性结合并且重新抑制其对RAD51 mRNA的抑制来调节RAD51 mRNA的稳定性。我们的研究结果揭示了lnc-RI通过lnc-RI/miR-193a-3p/RAD51 mRNA 3’UTR轴调节HR途径的新机制。
结 果
1
lnc-RI表达与微核形成的负相关
微核通过染色体断裂或损失在有核细胞中形成，并且通常被认为是基因组不稳定性的生物标志物。我们以前的发现表明，lnc-RI是一种辐射诱导的lncRNA分子，参与辐射诱导的DDRs。因此，我们假设lnc-RI与基因组完整性相关。为了验证这一假设，我们首先研究了21个健康供体的外周血淋巴细胞中lnc-RI表达与微核率之间的潜在关系。使用胞质分裂阻滞（CB）微核的实时PCR分析lnc-RI表达水平和微核率分析的结果如表1所示。图1的数据表明微核频率与lnc-RI表达负相关，这暗示lnc-RI可能涉及维持基因组稳定性。
2
抑制lnc-RI表达增加了多个细胞系中自发性DSB的积累
我们之前的研究表明，一些DDR相关基因的表达在lnc-RI敲低细胞中被破坏。在本研究中，我们发现lnc-RI的启动子含有NF-κB（p65）结合位点（在+71bp和+81bp之间）。然后我们证实lnc-RI可能通过NF-κB（p65）依赖性方式的辐射诱导。接下来，我们发现lnc-RI敲低可能使HeLa细胞对辐射敏感。DNA双链断裂。与siRNA-NC相比，siRNA-Inc-RI＃1和＃2有效抑制lnc-RI的表达，显著增加γ-H2AX和γ-H2AX灶形成。在MCF-7和LO2细胞中观察到类似的结果。这些结果表明，敲低lnc-RI表达显著增加自发性DSB的积累。
在进一步的研究中，进行中性彗星试验以检测转染特异性siRNA后24小时或48小时HeLa和U2OS细胞中DSB的产量。在用lnc-RI特异性siRNA转染的细胞中DNA片段显著增加。我们证实，lnc-RI的敲低增加了多种细胞类型中的自发DSB水平。
3
lnc-RI通过调节RAD51表达调节DSB的同源修复
我们使用在U2OS细胞中充分表征的HR报告基因测定（DR-GFP）研究了lnc-RI对DSB的HR活性的影响。与对照细胞相比，lnc-RI敲低导致GFP信号显著降低，表示I-Sce I在报道构建体中产生的DSB的HR修复效率。
接下来，我们尝试鉴定lnc-RI的靶标，其中lnc-RI调节HR活性，HR途径中几种必需蛋白的表达（MRE11，RAD50，NBS1，RAD51，BRCA1，BRCA2，PLK1和BCL2）是通过WB印迹检测。HeLa和U2OS细胞中lnc-RI的敲低显著抑制RAD51和PLK1表达。还发现一些HR途径相关蛋白（RAD50，BRCA1，BRCA2）的表达在一定程度上被抑制。接下来，我们在lnc-RI敲低细胞中过量表达RAD51和PLK1，仅过表达RAD51可以减弱由lnc-RI敲低诱导的γ-H2AX水平。
上述所有证据表明，RAD51是一个关键目标，通过该目标，lnc-RI在HR途径中发挥作用，并为我们提供一个线索，即lnc-RI可以调节RAD51表达作为ceRNA。
4
lnc-RI是稳定RAD51 mRNA所必需的
进一步研究了由lnc-RI敲低诱导RAD51抑制的机制。RNA介导的HeLa和U2OS细胞中的lnc-RI敲低导致蛋白质和mRNA水平的RAD51表达降低。接下来，我们研究了lnc-RI调节RAD51 mRNA和蛋白质稳定性的能力。用LV-KD-Inc-RI感染HeLa细胞。在加入环己酰亚胺（CHX）以阻断翻译后1,2,4,8和12小时的Western印迹分析表明，lnc-RI敲低对RAD51蛋白的降解没有影响。相反，在加入放线菌素D（CHD）以阻断转录后的定量实时PCR分析揭示了在lnc-RI敲低细胞中RAD51 mRNA的快速降解。这些数据表明lnc-RI对于稳定RAD51 mRNA是必需的。
5
lnc-RI通过与miR-193a-3-p的竞争性结合调节RAD51 mRNA的稳定性
miRNA结合靶mRNA分子的3’UTR区域以促进其降解。据报道，LncRNA可以竞争性地结合miRNA来调节mRNA的稳定性。抑制lnc-RI促进RAD51 mRNA的降解。此外，RAD51 mRNA的敲低也抑制了lnc-RI表达，表明lnc-RI可通过竞争性结合某些miRNA来调节RAD51 mRNA的稳定性。
通过搜索开放数据库RegRNA2.0，Tar-getScan，miRDB，miRTarBase，starBase v2.0和microRNA.org-靶标和表达，五种候选miRNA（miR-328，miR-193a-3p，miR-193b-3p，miR-34c-5p和miR-449a）靶向RAD51 mRNA 3’UTR序列和lnc-RI，所有这些都已报道影响肿瘤致癌作用或DDR。
分别用5种候选miRNA的模拟物转染HeLa细胞，并通过实时PCR或Western印迹分析检测lnc-RI和RAD51的表达。所有五种miRNA模拟物均抑制RNA水平的lnc-RI和RAD51的表达。此外，发现miR-193a-3p和miR-34c-5p介导RAD51蛋白表达的最显著抑制。这些结果暗示miR-193a-3p和miR-34c-5p可能是miR-NAs，lnc-RI通过其调节RAD51 mRNA的稳定性。
为了确认miRNA（miR-193a-3p和miR-34c-5p）的直接相互作用，含有miR-193a-3p或miR-34c-5p结合位点的RAD51 mRNA的lnc-RI或3’UTR区域的序列是分别克隆到pGL3M质粒的荧光素酶基因的下游。然后用这些报告质粒和miR-193a-3p或miR-34c-5p共转染HeLa细胞。虽然miR-193a-3p显著抑制两种候选靶序列的荧光素酶活性，但miR-34c-5p对任一候选靶序列均无影响。因此，我们在进一步的研究中关注miR-193a-3p。
在用构建的质粒和miR-193a-3p模拟物（或阴性对照模拟物）共转染HeLa细胞后48小时的相对荧光素酶活性的分析揭示miR-193a-3p结合位点的突变减弱。在用lnc-RI-wt和RAD51 3’UTR-wt构建体转染的细胞中，由miR-193a-3p介导的两种候选靶序列的荧光素酶活性的抑制。然而，RAD51 mRNA 3’UTR 704-724 bp突变体并未完全缓解miR-193a-3p对RAD51 3’UTR相关荧光素酶活性的抑制作用，表明RAD51 mRNA 3’UTR序列中可能存在其他miR-193a-3p靶位点。这些结果表明miR-193a-3p通过直接相互作用调节lnc-RI和RAD51的表达。
讨 论
在本研究中，内源性lncRNA lnc-RI表达与自发微核率之间存在显著的负相关，并且lnc-RI的敲除显示出显著增加多种细胞类型中的DSB积累。我们揭示了lnc-RI在DSB修复的HR途径中起作用，尽管通过与miR-193a-3p竞争结合3'UTR区域来调节RAD51 mRNA稳定化。Lnc-RI作为ceRNA起作用以减轻miR-193a-3p对RAD51表达的抑制作用。这些发现为支持lnc-RI在维持基因组稳定性中的关键作用提供了有力的证据。
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