A regulated PNUTS mRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumor progression

A regulated PNUTS mRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumor progression

受调节的PNUTS mRNA至lncRNA剪接开关介导EMT和肿瘤进展

期刊：Nature Cell Biology；影响因子：19.064

发表单位：南卡罗来纳州医科大学      

    ceRNA需要lncRNA, miRNA, mRNA三种分子，miRNA, mRNA可以综合表达量变化，保守性，肿瘤重要功能选择。本研究，lncRNA通过ceRNA机制调控肿瘤上皮-间充质转换，首先建立EMT模型，芯片筛选差异表达的lncRNA，而后根据EMT中的作用及其在物种间的高度保守性选择其竞争结合的miRNA，而后验证上皮-间充质转换重要的基因作为miRNA靶基因如ZEB，E-钙粘蛋白。    

    lncRNA对肿瘤进展和驱动其表达的调节机制的被广泛研究。在这里，我们发现异质核核糖核蛋白E1（hnRNPE1）与位于PNUTS pre-RNA的外显子12中的核酸结构元件的结合，调节其可变剪接。允许选择性剪接并产生PNUTS的非编码同种型。功能上，lncRNA-PNUTS在上皮-间充质转换期间用作miR-205的竞争性海绵。lncRNA-PNUTS的表达升高并且与ZEB mRNA的水平相关。因此，PNUTS是编码PNUTS-mRNA和lncRNA-PNUTS的双功能RNA，每个都引发不同的生物学功能。虽然PNUTS-mRNA普遍表达，但lncRNA-PNUTS似乎依赖于hnRNPE1的状态和肿瘤背景而受到严格调节。

    非编码RNA最近通过调节致癌和肿瘤抑制通路而成为肿瘤进展的关键介质。LncRNA与细胞过程有关，例如增殖，凋亡，迁移和细胞侵袭，并且已经在各种人类癌症中观察到它们的失调表达。上皮-间质转化（EMT）是在上皮细胞的肿瘤进展期间异常重新激活的发育过程，并且有助于常规和靶向治疗的抗性。在这里，我们报告hnRNPE1与PNUTS pre-RNA中的可变剪接位点的结合，以控制PNUTS的可变剪接同种型的产生，我们将其描述为参与EMT相关肿瘤进展的lncRNA。             

    在NMuMG细胞中使用hnRNPE1敲低诱导的EMT模型，我们进行了Affymetrix阵列分析并鉴定了在hnRNPE1敲低时下调的PNUTS pre-RNA，而相关的PNUTS-mRNA保持相对不受影响（图1a）暗示PNUTS pre-RNA的差异处理。有趣的是，人PNUTS基因被描述为编码两种测序变体。虽然变体1编码了良好表征的PNUTS-mRNA，但变体2尚未被研究并且预测为lncRNA（图1b）。我们使用特异于PNUTS同种型的引物通过RT-PCR分析验证了PNUTS pre-RNA的差异处理（图1c）。

    我们观察到乳腺肿瘤样品中预测的lncRNA-PNUTS的上调以及ZEB1/ZEB2间充质标志物表达和lncRNA-PNUTS之间的相关性（图1d），而不是PNUTS-mRNA。我们还观察到lncRNA-PNUTS表达与乳腺癌细胞的上皮/间充质状态之间的相关性。在更多的间充质MDA-MB-231细胞系及其转移性骨（BOM-1833）和转移性肺（LM2-4175）衍生物中，我们观察到预测的lncRNA-PNUTS的表达增加与间充质标记物波形蛋白和Zeb1的表达相关。

    NCBI数据库预测lncRNA-PNUTS的产生是由于在外显子12的5'区域中去除了61个碱基导致转录物的开放阅读框（ORF）中断（图1f，1g）。并且northern-blot验证了全长lncRNA-PNUTS的大小及其在hnRNPE1敲低后的上调（图1i）。

    PNUTS基因的外显子12中的备选剪接位点也由HSFfinder在计算机上预测。有趣的是，该剪接位点具有比用于产生PNUTS-mRNA的常规剪接位点（79.38）更高的共有剪接位点值（91.74），表明存在选择性剪接位点利用的抑制机制。由于hnRNPE1是已知的选择性剪接的抑制因子并且其敲低导致lncRNA-PNUTS的上调，我们推测它是PNUTS pre-RNA剪接的内源阻遏物。

    我们先前描述了hnRNPE1结合共有BAT元件，其由具有位于RNAs的3'-UTR中的不对称凸起的茎环结构组成。对人和小鼠序列中PNUTS可变剪接位点的二级结构的分析揭示了存在类似的进化保守的BAT样元件，其包含可变剪接位点。因此，我们设计了PNUTSBAT选择性剪接位点RNA探针，野生型或突变，以进行RNA电动转移测定（REMSA）并验证hnRNPE1与结构元件的直接和特异性结合。结果表明hnRNPE1与PNUTS pre-RNA选择性剪接位点的结合介导了对可变剪接的抑制作用。

    PNUTS mRNA编码99 kDa PNUTS蛋白。多核糖体分级分析，与PNUTS mRNA相比，仅在非翻译单体组分中观察到lncRNA-PNUTS而在活跃翻译的多核组分中没有观察到，说明了其不可翻译性。最后，内源性lncRNA-PNUTS具有poly（A）尾，并且通过细胞组分分析，使用MS2-Tag策略和FISH分析的GFP跟踪显微镜观察位于细胞质和细胞核中。

    鉴于lncRNA-PNUTS的亚细胞定位，我们接下来将其生物学功能探索为假定的竞争内源RNA（ceRNA）。通过计算机分析，我们预测了21个靶向至少5个位点的miRNA，得分高于0.6。miR-205由于其在EMT中的关键作用及其在物种间的高度保守性而成为明显的候选物。我们使用定量实时PCR来量化每个细胞的miR-205和lncRNA-PNUTS的拷贝数，因为可比较的水平暗示了ceRNA功能。FISH分析显示miR-205与lncRNA-PNUTS而非PNUTS-mRNA的共定位。这表明miR-205与lncRNA同种型的优先相互作用，其通过使用生物素化的反义探针进一步证实。LncRNA-PNUTS含有7个miR-205位点，包括位于同源PNUTS mRNA的3'-UTR中的位点。

    由于lncRNA-PNUTS与miRNA-205相互作用，miRNA-205是一种成熟的ZEB蛋白和上皮细胞维持的调节因子，我们研究了它对ZEB表达和细胞可塑性的影响。我们沉默内源性lncRNA-PNUTS在间充质和侵袭性MDA231-LM2-4175细胞中表达高水平的lncRNA，以测试lncRNA-PNUTS是否可以调节细胞可塑性。LncRNA-PNUTS沉默导致细胞侵袭的显著降低与波形蛋白表达减少（间充质标记物）和上皮标记物E-钙粘蛋白的重新表达相关，伴随形态变化。此外，lncRNA-PNUTS的过表达在A549和NMuMG中诱导EMT，其特征在于从上皮样，鹅卵石表型到更多纺锤形的间充质表型，E-钙粘蛋白/波形蛋白转换的形态学变化，以及伴随的EMT-TF，ZEB1，ZEB2，SNAI1和SNAI2水平的增加。虽然野生型lncRNA-PNUTS诱导与E-钙粘蛋白下调和ZEB1上调相关的EMT，但miRNA-205的共转染以及lncRNA-PNUTS的miR-205-突变体形式的过表达消除了这个效果。lncRNA-PNUTS以miR-205结合位点依赖性方式控制A549和NMuMG细胞的迁移和侵袭，并且miR-205过表达能够消除这种效应。

    使用荧光素酶报告基因测定，我们接下来通过lncRNA-PNUTS验证了miR-205/ZEB/E-钙粘蛋白轴的调节。我们首先通过克隆lncRNA-PNUTS的S3-S6-miR-205结合位点作为荧光素酶CDS的3'-UTR证实了miR-205与lncRNA-PNUTS的结合，并证明了共转染A549和NMUMG细胞中的miR-205降低了野生型（WT）的荧光素酶表达，但没有突变的S3-S6-miR205构建体。其次，使用荧光素酶报告基因构建体，其稳定性依赖于miR-205结合，我们证明了WT，而不是miR-205-突变的lncRNA-PNUTS降低了miR-205的生物利用度。第三，使用与ZEB3'-UTR融合的海肾结构，我们观察到WT lncRNA-PNUTS稳定了ZEBs 3'-UTR，并且使用miR-205突变的lncRNA或通过与miR-205模拟物共转染逆转部分地消除了这种效应。重要的是，对于其miR-205结合位点突变的ZEB13'-UTR没有观察到效果。最后，使用含有野生型或突变型ZEBs结合位点（E盒）的E-钙粘蛋白（CDH1）启动子荧光素酶构建体，我们观察到lncRNA-PNUTS过表达后荧光素酶活性降低约50％。

    鉴于miR-205在通过EMT调节乳腺干细胞命运和肿瘤发生中的作用，我们研究了lncRNA-PNUTS是否有助于这些表型。利用立体球形成测定法，我们显示依赖于miR-205结合位点的lncRNA-PNUTS诱导的A549和NMuMG细胞的球形成显著增加。我们接下来测试了lncRNA-PNUTS对体内肿瘤进展的影响，并证明当在原位注射到乳腺脂肪垫中时，MDA-231-LM2细胞中lncRNA-PNUTS的沉默损害肿瘤形成。此外，lncRNA-PNUTS也有助于体内转移，因为我们观察到与其杂乱控制对照组相比，对于lncRNA-PNUTS沉默的MDA-231-LM2细胞中肺定植显著减少。              

    LncRNA-PNUTS定位于细胞质和细胞核中，虽然其作为ceRNA的功能可归因于其细胞质定位，但其在核区室中的作用未在本文中研究。lncRNA-PNUTS的核生物发生可能解释了它在细胞核中的定位，尽管我们推测它也可能参与核过程，如转录或表观遗传调控，如同其他先前描述的lncRNAs。