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LncRNA MT1DP Aggravates Cadmium-Induced Oxidative Stress by Repressing the Function of Nrf2 and is Dependent on Interaction with miR-365

文字:[大][中][小] 2018/10/25     浏览次数:    

LncRNA MT1DP Aggravates Cadmium-Induced Oxidative Stress by Repressing the Function of Nrf2 and is Dependent on Interaction with miR-365

LncRNA MT1DP通过抑制Nrf2的功能加重镉诱导的氧化应激,并且依赖于与miR-365的相互作用


期刊Advanced Science影响因子:12.441

发表单位:中国科学院          


导 读

    之前介绍了lncRNA在转录后水平通过ceRNA发挥调控mRNA的机制,如“这篇lncRNA ceRNA机制如何发到 IF12分的”,“胃癌lncRNA ceRNA机制研究”,“Cancer Cell: lncARSR通过ceRNA调控肿瘤耐药(IF: 22.844”。那么lncRNAmiRNAmRNA的关系就一定是ceRNA的关系吗,本研究发现lncRNA MT1DP可以结合稳定miR-365,增强其对靶基因Nrf2的抑制作用。一起来看看文章是怎么研究的吧。     


摘 要

    尽管已经确定了镉(Cd)诱导的肝毒性,但关于Cd毒性的机制并不明确。此外,我们建立了lncRNA MT1DP与核因子红细胞2相关因子2Nrf2)之间的桥分子:miR-365。机制上,在Cd胁迫下MT1DP调控Nrf2水平,通过miR-365的升高引起氧化应激,miR-365通过直接结合其3'UTR来抑制Nrf2水平。与竞争性内源性RNAceRNA)机制相反,提出了一种新的机制:MT1DP通过直接结合稳定其RNA来提高miR-365水平        


介 绍

    镉(Cd)被认为是环境中最常见的有毒重金属之一。在最初的Cd暴露时,细胞抗氧化系统(包括酶促抗氧化剂和其他生存分子)被激活以对抗Cd诱导的损伤。核因子红细胞2相关因子2Nrf2)是一种重要的抗氧化剂转录因子也被Cd激活,通过反式激活抗氧化分子,包括血红素氧合酶-1HO-1)和超氧化物歧化酶(SOD),通过与抗氧化反应元素的结合,保护细胞免受氧化应激。然而,与促生存信号相比,关于细胞内促凋亡信号传导的知识要少得多。迄今为止,对Cd有反应活性的细胞内促凋亡分子以及Cd如何牵连刺激这些促凋亡分子仍然很不清楚。            


结 果

1

MT1DP表达受Cd诱导的氧化应激

    我们最近发现lncRNA MT1DP是促进Cd诱导的细胞凋亡的关键调节因子。然而,MT1DP诱导是否受Cd诱导的氧化应激仍然不清楚。为了解决这个问题,我们确定了各种内源性氧化应激条件下的MT1DP水平。细胞内ROS氧化应力在1020μm处理6小时的Cd处理后显著增加30%以上(p<0.05)。同样地,相对于未处理的细胞,在1020μmCd持续6小时(p<0.001)处理后,MT1DP的表达水平增加了20倍以上,这表明Cd与触发氧化应激和MT1DP诱导之间的密切相关性。这些数据表明通过Cd处理的MT1DP诱导至少部分地受到氧化应激。


2

MTF1决定Cd暴露后转录水平的MT1DP表达

    鉴于具有金属响应元件(MRE)的MT1亚家族成员可被金属响应转录因子1MTF-1)识别和激活,我们假设MT1DP也可能是MTF1的下游目标。类似于MT1DPMTF1水平也由Cd处理下的氧化应激驱动,因为Cd处理增加了MTF1水平。尽管在MTF1敲低细胞中Cd仍然可以显著促进MT1DP诱导(p<0.001),但MTF1敲低细胞中MT1DP水平的诱导要比对应的乱序对照细胞弱得多(降低70%)。因此,这些发现表明MT1DPMTF1的下游靶标。

    随后的生物信息学分析揭示了在MT1DP的启动子区域内具有两个潜在的MRE的区域。染色质免疫沉淀分析显示,与正常IgGp<0.001)和参考区域相比,MTF1抗体(Ab)极大地富集了具有潜在的MRE(启动子中的-320-220)的区域近6,(-99-1在启动子)没有普通的MRE被用作阴性对照。这些结果表明MT1DPCd处理后通过转录阶段的MRE直接受MTF1调节。


3

MT1DP诱导加剧Cd毒性

    为了理解MT1DP诱导对Cd暴露的生理功能,我们使用shRNA策略将内源性MT1DPHepG2细胞中敲低~80%。Cd诱导对照细胞中丙二醛(MDA)的增加而在MT1DP敲低细胞中观察到MDA含量没有显著变化。为了证实MT1DP在调节Cd处理下的细胞氧化还原状态中的作用,还测定了抗氧化指标SOD,过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物(GSH/GSSG)比率。当MT1DP被敲低时,SODCAT活性的降低以及响应CdGSH/GSSG比率均显著逆转p<0.05),表明MT1DP是一种新型调节剂Cd诱导的氧化应激。在MT1DP敲低细胞中Cd诱导的剂量依赖性ROS产生也显著减弱p<0.05),表明MT1DP在响应Cd时引起氧化应激的重要作用。


4

MT1DP抑制Nrf2水平以增强镉处理后的ROS累积

    接下来,我们试图描绘MT1DP依赖性ROS促进的分子基础。作为主要调节因子,Nrf2通过多种机制起到抵抗氧化应激相关细胞损伤的作用,包括通过诱导抗氧化成分(如HO-1SOD1)去除自由基。特别是,Nrf2已经显示出对Cd诱导的肝毒性起关键作用。在这里,我们努力阐明MT1DPNrf2的潜在调节作用。与先前的研究一致,Cd处理显著增加HepG2细胞中的Nrf2浓度。在添加Cd时,这种浓度增加可能在具有Nrf2敲低的细胞中受到严重损害。与先前的研究结果一致,与对照细胞相比,Nrf2敲低使Cd诱导的剂量依赖性ROS产生增加了15-18%,这突出了Nrf2在对抗Cd诱导的氧化应激中的重要作用。

    为了确定Nrf2MT1DP之间的联系,我们接下来研究了MT1DPNrf2相互敲低后的变化。Nrf2敲低对MT1DP的表达没有显著影响。然而,随着MT1DP的减少,Cd诱导的Nrf2积累可以在细胞中增强。同时,在具有MT1DP过表达的细胞中,CdNrf2的诱导显著逆转。因此,这些观察揭示了MT1DPNrf2的调节,特别是在Cd诱导的氧化应激下。


5

miR-365是降低Nrf2MT1DP的中间下游

    为了解释MT1DP如何调节Nrf2水平的机制,我们搜索了可以结合MT1DPNrf2的伴侣分子。MT1DPNrf2 3'UTRmiR-365上共享共有结合位点,提示这三种RNA分子之间的调节机制。为了进一步研究,我们将Nrf2mRNA3'UTR克隆到荧光素酶报告基因中,以测试miR-365Nrf2表达的影响。应用miR-365模拟物后,pGL3-Nrf2-3'UTR的相对荧光素酶活性显著下降90%(p<0.05)。然而,当Nrf23'UTRmiR-365的结合位点发生突变时,miR-365Nrf2-3'UTR活性的抑制作用也显著受损。类似地,miR-365模拟物也有效抑制Cd诱导的Nrf2蛋白积累,进一步证实即使在Cd处理下Nrf2也直接被miR-365调节。

6

MT1DP增强miR-365RNA稳定性

    有趣的是澄清MT1DP如何调节miR-365以使后者对Nrf2起作用。为了回答这个问题,我们调查了MT1DPmiR-365的调节。与乱序对照细胞相比,MT1DP shRNA细胞中MT1DP敲低后miR-365水平显著降低了50p<0.05)。相比之下,MT1DP过表达细胞中miR-365水平相对于载体对照细胞中的水平增加了150p<0.05)。值得注意的是,miR-365模拟物对MT1DP的水平没有显著影响,排除了miR-365MT1DP之间的相互调节。为了理解MT1DPmiR-365水平的调节活性的潜在机制,通过使用MS2发夹标记的MT1DP进行RNA-pull down测定以阐明MT1DP是否可以直接结合miR-365。与MS2-载体对照细胞中相比,miR-365MS2-MT1DP pull down细胞裂解物中更高度富集(p<0.05),指向两者间具有直接相互作用。此外,MT1DP缺乏对pri-miR-365的表达没有影响,表明MT1DP在转录水平上不调节miR-365。为了进一步理解控制MT1DPmiR-365的分子基础,miR-365是一种DNA转录和复制的抑制剂,用放线菌素/放线菌素DActD)来阻断miR-365的转录。在用ActD处理后,miR-365的内源表达水平在6-12小时内逐渐下降(p<0.05;然而,在ActD处理的细胞中MT1DP的过表达显著阻断了miR-365的下降(p<0.05)。相反,在MT1DP敲低后,在ActD处理的细胞中miR-365的下降速率进一步加速。总之,我们的数据表明MT1DP通过增强miR-365RNA稳定性来提高miR-365浓度       


讨 论

    MT1DP是属于MT1亚家族的假基因,特异性存在于人类基因组中。以前的研究表明MT1DP通过调节YAPRunx2作为肿瘤抑制因子促进肝细胞凋亡。然而,MT1DP的生物学功能仍然很大程度上未知。本研究的一项主要发现是通过桥分子miR-365阐明MT1DPNrf2之间的联系。Nrf2是一种主要的调节因子,可以驱动许多抗氧化剂和解毒酶的表达。Nrf2蛋白质诱导是对Cd诱导的氧化应激的适应性反应,去除细胞内ROS,因此,由于抗氧化剂和解毒酶水平不足,Nrf2缺乏会显著增强氧化应激相关的细胞损伤。我们的研究结果显示,Cd诱导的MT1DP负调节Nrf2浓度以引起氧化应激,重要的是,我们定义了MT1DP的下游中间体miR-365,其作用是抑制Nrf2水平。



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