LncRNA MT1DP Aggravates Cadmium-Induced Oxidative Stress by Repressing the Function of Nrf2 and is Dependent on Interaction with miR-365

LncRNA MT1DP Aggravates Cadmium-Induced Oxidative Stress by Repressing the Function of Nrf2 and is Dependent on Interaction with miR-365

LncRNA MT1DP通过抑制Nrf2的功能加重镉诱导的氧化应激，并且依赖于与miR-365的相互作用

期刊：Advanced Science；影响因子：12.441

发表单位：中国科学院          

    之前介绍了lncRNA在转录后水平通过ceRNA发挥调控mRNA的机制，如“这篇lncRNA ceRNA机制如何发到 IF12分的”，“胃癌lncRNA ceRNA机制研究”，“Cancer Cell: lncARSR通过ceRNA调控肿瘤耐药（IF: 22.844）”。那么lncRNA、miRNA、mRNA的关系就一定是ceRNA的关系吗，本研究发现lncRNA MT1DP可以结合稳定miR-365，增强其对靶基因Nrf2的抑制作用。一起来看看文章是怎么研究的吧。     

    尽管已经确定了镉（Cd）诱导的肝毒性，但关于Cd毒性的机制并不明确。此外，我们建立了lncRNA MT1DP与核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）之间的桥分子：miR-365。机制上，在Cd胁迫下MT1DP诱调控Nrf2水平，通过miR-365的升高引起氧化应激，miR-365通过直接结合其3'UTR来抑制Nrf2水平。与竞争性内源性RNA（ceRNA）机制相反，提出了一种新的机制：MT1DP通过直接结合稳定其RNA来提高miR-365水平。        

    镉（Cd）被认为是环境中最常见的有毒重金属之一。在最初的Cd暴露时，细胞抗氧化系统（包括酶促抗氧化剂和其他生存分子）被激活以对抗Cd诱导的损伤。核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）是一种重要的抗氧化剂转录因子也被Cd激活，通过反式激活抗氧化分子，包括血红素氧合酶-1（HO-1）和超氧化物歧化酶（SOD），通过与抗氧化反应元素的结合，保护细胞免受氧化应激。然而，与促生存信号相比，关于细胞内促凋亡信号传导的知识要少得多。迄今为止，对Cd有反应活性的细胞内促凋亡分子以及Cd如何牵连刺激这些促凋亡分子仍然很不清楚。            

    我们最近发现lncRNA MT1DP是促进Cd诱导的细胞凋亡的关键调节因子。然而，MT1DP诱导是否受Cd诱导的氧化应激仍然不清楚。为了解决这个问题，我们确定了各种内源性氧化应激条件下的MT1DP水平。细胞内ROS氧化应力在10和20μm处理6小时的Cd处理后显著增加30％以上（p<0.05）。同样地，相对于未处理的细胞，在10和20μm的Cd持续6小时（p<0.001）处理后，MT1DP的表达水平增加了20倍以上，这表明Cd与触发氧化应激和MT1DP诱导之间的密切相关性。这些数据表明通过Cd处理的MT1DP诱导至少部分地受到氧化应激。

    鉴于具有金属响应元件（MRE）的MT1亚家族成员可被金属响应转录因子1（MTF-1）识别和激活，我们假设MT1DP也可能是MTF1的下游目标。类似于MT1DP，MTF1水平也由Cd处理下的氧化应激驱动，因为Cd处理增加了MTF1水平。尽管在MTF1敲低细胞中Cd仍然可以显著促进MT1DP诱导（p<0.001），但MTF1敲低细胞中MT1DP水平的诱导要比对应的乱序对照细胞弱得多（降低70％）。因此，这些发现表明MT1DP是MTF1的下游靶标。

    随后的生物信息学分析揭示了在MT1DP的启动子区域内具有两个潜在的MRE的区域。染色质免疫沉淀分析显示，与正常IgG（p<0.001）和参考区域相比，MTF1抗体（Ab）极大地富集了具有潜在的MRE（启动子中的-320至-220）的区域近6倍，（-99至-1在启动子）没有普通的MRE被用作阴性对照。这些结果表明MT1DP在Cd处理后通过转录阶段的MRE直接受MTF1调节。

    为了理解MT1DP诱导对Cd暴露的生理功能，我们使用shRNA策略将内源性MT1DP在HepG2细胞中敲低~80％。Cd诱导对照细胞中丙二醛（MDA）的增加，而在MT1DP敲低细胞中观察到MDA含量没有显著变化。为了证实MT1DP在调节Cd处理下的细胞氧化还原状态中的作用，还测定了抗氧化指标SOD，过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（GSH/GSSG）比率。当MT1DP被敲低时，SOD和CAT活性的降低以及响应Cd的GSH/GSSG比率均显著逆转（p<0.05），表明MT1DP是一种新型调节剂Cd诱导的氧化应激。在MT1DP敲低细胞中Cd诱导的剂量依赖性ROS产生也显著减弱（p<0.05），表明MT1DP在响应Cd时引起氧化应激的重要作用。

    接下来，我们试图描绘MT1DP依赖性ROS促进的分子基础。作为主要调节因子，Nrf2通过多种机制起到抵抗氧化应激相关细胞损伤的作用，包括通过诱导抗氧化成分（如HO-1和SOD1）去除自由基。特别是，Nrf2已经显示出对Cd诱导的肝毒性起关键作用。在这里，我们努力阐明MT1DP对Nrf2的潜在调节作用。与先前的研究一致，Cd处理显著增加HepG2细胞中的Nrf2浓度。在添加Cd时，这种浓度增加可能在具有Nrf2敲低的细胞中受到严重损害。与先前的研究结果一致，与对照细胞相比，Nrf2敲低使Cd诱导的剂量依赖性ROS产生增加了15-18％，这突出了Nrf2在对抗Cd诱导的氧化应激中的重要作用。

    为了确定Nrf2和MT1DP之间的联系，我们接下来研究了MT1DP和Nrf2相互敲低后的变化。Nrf2敲低对MT1DP的表达没有显著影响。然而，随着MT1DP的减少，Cd诱导的Nrf2积累可以在细胞中增强。同时，在具有MT1DP过表达的细胞中，Cd对Nrf2的诱导显著逆转。因此，这些观察揭示了MT1DP对Nrf2的调节，特别是在Cd诱导的氧化应激下。

    为了解释MT1DP如何调节Nrf2水平的机制，我们搜索了可以结合MT1DP和Nrf2的伴侣分子。MT1DP和Nrf2 3'UTR在miR-365上共享共有结合位点，提示这三种RNA分子之间的调节机制。为了进一步研究，我们将Nrf2mRNA的3'UTR克隆到荧光素酶报告基因中，以测试miR-365对Nrf2表达的影响。应用miR-365模拟物后，pGL3-Nrf2-3'UTR的相对荧光素酶活性显著下降90％（p<0.05）。然而，当Nrf2的3'UTR内miR-365的结合位点发生突变时，miR-365对Nrf2-3'UTR活性的抑制作用也显著受损。类似地，miR-365模拟物也有效抑制Cd诱导的Nrf2蛋白积累，进一步证实即使在Cd处理下Nrf2也直接被miR-365调节。

    有趣的是澄清MT1DP如何调节miR-365以使后者对Nrf2起作用。为了回答这个问题，我们调查了MT1DP对miR-365的调节。与乱序对照细胞相比，MT1DP shRNA细胞中MT1DP敲低后miR-365水平显著降低了50％（p<0.05）。相比之下，MT1DP过表达细胞中miR-365水平相对于载体对照细胞中的水平增加了150％（p<0.05）。值得注意的是，miR-365模拟物对MT1DP的水平没有显著影响，排除了miR-365和MT1DP之间的相互调节。为了理解MT1DP对miR-365水平的调节活性的潜在机制，通过使用MS2发夹标记的MT1DP进行RNA-pull down测定以阐明MT1DP是否可以直接结合miR-365。与MS2-载体对照细胞中相比，miR-365在MS2-MT1DP pull down细胞裂解物中更高度富集（p<0.05），指向两者间具有直接相互作用。此外，MT1DP缺乏对pri-miR-365的表达没有影响，表明MT1DP在转录水平上不调节miR-365。为了进一步理解控制MT1DP对miR-365的分子基础，miR-365是一种DNA转录和复制的抑制剂，用放线菌素/放线菌素D（ActD）来阻断miR-365的转录。在用ActD处理后，miR-365的内源表达水平在6-12小时内逐渐下降（p<0.05）;然而，在ActD处理的细胞中MT1DP的过表达显著阻断了miR-365的下降（p<0.05）。相反，在MT1DP敲低后，在ActD处理的细胞中miR-365的下降速率进一步加速。总之，我们的数据表明MT1DP通过增强miR-365RNA稳定性来提高miR-365浓度。       

    MT1DP是属于MT1亚家族的假基因，特异性存在于人类基因组中。以前的研究表明MT1DP通过调节YAP和Runx2作为肿瘤抑制因子促进肝细胞凋亡。然而，MT1DP的生物学功能仍然很大程度上未知。本研究的一项主要发现是通过桥分子miR-365阐明MT1DP与Nrf2之间的联系。Nrf2是一种主要的调节因子，可以驱动许多抗氧化剂和解毒酶的表达。Nrf2蛋白质诱导是对Cd诱导的氧化应激的适应性反应，去除细胞内ROS，因此，由于抗氧化剂和解毒酶水平不足，Nrf2缺乏会显著增强氧化应激相关的细胞损伤。我们的研究结果显示，Cd诱导的MT1DP负调节Nrf2浓度以引起氧化应激，重要的是，我们定义了MT1DP的下游中间体miR-365，其作用是抑制Nrf2水平。

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