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LncRNA lnc-RI regulates homologous recombination repair of DNA double-strand breaks by stabilizing RAD51 mRNA as a competitive endogenous RNA

文字:[大][中][小] 2018/10/25     浏览次数:    

LncRNA lnc-RI regulates homologous recombination repair of DNA double-strand breaks by stabilizing RAD51 mRNA as a competitive endogenous RNA

LncRNA lnc-RI通过稳定RAD51 mRNA作为竞争性内源RNA来调节DNA双链断裂的同源重组修复


期刊:Nucleic Acids Research;影响因子:11.561

发表单位:北京理工大学           


导 读

    LncRNA调节mRNA表达,五孔不入,几乎参与各种生物学过程,本研究发现电离辐射诱导DNA双链断裂修复过程中,lnc-RI竞争性结合miR-193a-3p促进RAD51表达发挥DNA双链断裂修复。                


摘 要

    DNA双链断裂(DSB)修复对于维持基因组稳定性至关重要。目前DSB修复机制的模型基于DNA修复蛋白的研究。我们发现电离辐射诱导的lncRNAlnc-RI的表达与人外周血淋巴细胞中的微核频率呈负相关。抑制lnc-RI显著增加自发性DSB水平,这被证实与DSB的同源重组(HR)修复效率降低有关。我们证明了miR-193a-3p可以与lnc-RI和RAD51 mRNA结合并抑制lnc-RI和RAD51 mRNA的表达Lnc-RI作为竞争性内源RNAceRNA)通过与miR-193a-3p的竞争性结合和释放其对RAD51表达的抑制来稳定RAD51 mRNA               


研究背景

    修复DNA损伤的异常是基因组不稳定的重要原因。 DNA双链断裂(DSBs)被认为是细胞寿命期间基因组完整性中最具灾难性的变化,通常由复制应激,基因毒性化学物质,电离辐射暴露,炎症等疾病引起。

长非编码RNAlncRNA)是一组非编码RNA转录物。LncRNAs在许多细胞生物学过程中发挥重要作用,包括细胞周期进程,细胞凋亡,发育,干细胞多能性,肌肉分化和癌发生。根据竞争性内源RNAceRNA)假说,特定RNA可作为miRNA海绵,以控制这些miRNA靶向的其他转录物的表达,而lncRNAsceRNA串扰过程的必要组成部分。我们的结果表明miR-193a-3p靶向RAD51lnc-RI,并且lnc-RI通过与miR-193a-3p竞争性结合并且重新抑制其对RAD51 mRNA的抑制来调节RAD51 mRNA的稳定性。我们的研究结果揭示了lnc-RI通过lnc-RI/miR-193a-3p/RAD51 mRNA 3’UTR轴调节HR途径的新机制。                     


结 果

1

lnc-RI表达与微核形成的负相关

    微核通过染色体断裂或损失在有核细胞中形成,并且通常被认为是基因组不稳定性的生物标志物。我们以前的发现表明,lnc-RI是一种辐射诱导的lncRNA分子,参与辐射诱导的DDRs。因此,我们假设lnc-RI与基因组完整性相关。为了验证这一假设,我们首先研究了21个健康供体的外周血淋巴细胞中lnc-RI表达与微核率之间的潜在关系。使用胞质分裂阻滞(CB)微核的实时PCR分析lnc-RI表达水平和微核率分析的结果如表1所示。图1的数据表明微核频率与lnc-RI表达负相关,这暗示lnc-RI可能涉及维持基因组稳定性。


2

抑制lnc-RI表达增加了多个细胞系中自发性DSB的积累

    我们之前的研究表明,一些DDR相关基因的表达在lnc-RI敲低细胞中被破坏。在本研究中,我们发现lnc-RI的启动子含有NF-κBp65)结合位点(在+71bp+81bp之间)。然后我们证实lnc-RI可能通过NF-κBp65)依赖性方式的辐射诱导。接下来,我们发现lnc-RI敲低可能使HeLa细胞对辐射敏感。DNA双链断裂。与siRNA-NC相比,siRNA-Inc-RI1和#2有效抑制lnc-RI的表达,显著增加γ-H2AXγ-H2AX灶形成。在MCF-7LO2细胞中观察到类似的结果。这些结果表明,敲低lnc-RI表达显著增加自发性DSB的积累。

在进一步的研究中,进行中性彗星试验以检测转染特异性siRNA24小时或48小时HeLaU2OS细胞中DSB的产量。在用lnc-RI特异性siRNA转染的细胞中DNA片段显著增加。我们证实,lnc-RI的敲低增加了多种细胞类型中的自发DSB水平。


3

lnc-RI通过调节RAD51表达调节DSB的同源修复

    我们使用在U2OS细胞中充分表征的HR报告基因测定(DR-GFP)研究了lnc-RIDSBHR活性的影响。与对照细胞相比,lnc-RI敲低导致GFP信号显著降低,表示I-Sce I在报道构建体中产生的DSBHR修复效率

接下来,我们尝试鉴定lnc-RI的靶标,其中lnc-RI调节HR活性,HR途径中几种必需蛋白的表达(MRE11RAD50NBS1RAD51BRCA1BRCA2PLK1BCL2)是通过WB印迹检测HeLaU2OS细胞中lnc-RI的敲低显著抑制RAD51PLK1表达。还发现一些HR途径相关蛋白(RAD50BRCA1BRCA2)的表达在一定程度上被抑制。接下来,我们在lnc-RI敲低细胞中过量表达RAD51PLK1,仅过表达RAD51可以减弱由lnc-RI敲低诱导的γ-H2AX水平

上述所有证据表明,RAD51是一个关键目标,通过该目标,lnc-RIHR途径中发挥作用,并为我们提供一个线索,即lnc-RI可以调节RAD51表达作为ceRNA


4

lnc-RI是稳定RAD51 mRNA所必需的

    进一步研究了由lnc-RI敲低诱导RAD51抑制的机制。RNA介导的HeLaU2OS细胞中的lnc-RI敲低导致蛋白质和mRNA水平的RAD51表达降低。接下来,我们研究了lnc-RI调节RAD51 mRNA和蛋白质稳定性的能力。用LV-KD-Inc-RI感染HeLa细胞。在加入环己酰亚胺(CHX)以阻断翻译后1,2,4,812小时的Western印迹分析表明,lnc-RI敲低对RAD51蛋白的降解没有影响。相反,在加入放线菌素DCHD)以阻断转录后的定量实时PCR分析揭示了在lnc-RI敲低细胞中RAD51 mRNA的快速降解。这些数据表明lnc-RI对于稳定RAD51 mRNA是必需的。


5

lnc-RI通过与miR-193a-3-p的竞争性结合调节RAD51 mRNA的稳定性

    miRNA结合靶mRNA分子的3UTR区域以促进其降解。据报道,LncRNA可以竞争性地结合miRNA来调节mRNA的稳定性。抑制lnc-RI促进RAD51 mRNA的降解。此外,RAD51 mRNA的敲低也抑制了lnc-RI表达,表明lnc-RI可通过竞争性结合某些miRNA来调节RAD51 mRNA的稳定性。

通过搜索开放数据库RegRNA2.0Tar-getScanmiRDBmiRTarBasestarBase v2.0microRNA.org-靶标和表达,五种候选miRNAmiR-328miR-193a-3pmiR-193b-3pmiR-34c-5pmiR-449a)靶向RAD51 mRNA 3UTR序列和lnc-RI,所有这些都已报道影响肿瘤致癌作用或DDR

    分别用5种候选miRNA的模拟物转染HeLa细胞,并通过实时PCRWestern印迹分析检测lnc-RIRAD51的表达。所有五种miRNA模拟物均抑制RNA水平的lnc-RIRAD51的表达。此外,发现miR-193a-3pmiR-34c-5p介导RAD51蛋白表达的最显著抑制。这些结果暗示miR-193a-3pmiR-34c-5p可能是miR-NAslnc-RI通过其调节RAD51 mRNA的稳定性。

    为了确认miRNAmiR-193a-3pmiR-34c-5p)的直接相互作用,含有miR-193a-3pmiR-34c-5p结合位点的RAD1 mRNAlnc-RI3’UTR区域的序列是分别克隆到pGL3M质粒的荧光素酶基因的下游。然后用这些报告质粒和miR-193a-3pmiR-34c-5p共转染HeLa细胞。虽然miR-193a-3p显著抑制两种候选靶序列的荧光素酶活性,但miR-34c-5p对任一候选靶序列均无影响。因此,我们在进一步的机械研究中关注miR-193a-3p

在用构建的质粒和miR-193a-3p模拟物(或阴性对照模拟物)共转染HeLa细胞后48小时的相对荧光素酶活性的分析揭示miR-193a-3p结合位点的突变减弱。在用lnc-RI-wtRAD51 3’UTR-wt构建体转染的细胞中,由miR-193a-3p介导的两种候选靶序列的荧光素酶活性的抑制。然而,RAD51 mRNA 3’UTR 704-724 bp突变体并未完全缓解miR-193a-3pRAD51 3’UTR相关荧光素酶活性的抑制作用,表明RAD51 mRNA 3’UTR序列中可能存在其他miR-193a-3p靶位点。这些结果表明miR-193a-3p通过直接相互作用调节lnc-RIRAD51的表达。 


讨 论

    在本研究中,内源性lncRNA lnc-RI表达与自发微核率之间存在显著的负相关,并且lnc-RI的敲除显示出显著增加多种细胞类型中的DSB积累。我们揭示了lnc-RIDSB修复的HR途径中起作用,尽管通过与miR-193a-3p竞争结合3'UTR区域来调节RAD51 mRNA稳定化。Lnc-RI作为ceRNA起作用以减轻miR-193a-3pRAD51表达的抑制作用。这些发现为支持lnc-RI在维持基因组稳定性中的关键作用提供了有力的证据。



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