Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA

Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA

外泌体传播的lncARSR通过作为竞争性内源RNA促进舒尼替尼在肾癌中的耐药性

期刊：Cancer Cell；影响因子：22.844               

发表单位：上海长征医院                                                        

    之前介绍过lncRNA在肿瘤耐药中发挥作用，“Nature medicine：EGFR同义突变引起靶向药耐药是由lncRNA EGFR-AS1介导的 （IF：32.621）”，“肿瘤耐药中lncRNA, miRNA是怎么发挥作用的呢”。本研究筛选耐药相关的lncRNA，发现lncARSR促进肾细胞癌舒尼替尼耐药。定位细胞质lnc，常以ceRNA机制发挥作用，如“这篇lncRNA ceRNA机制如何发到 IF12分的”，“胃癌lncRNA ceRNA机制研究”，本研究同样选择ceRNA阐释耐药机制，揭示lncARSR通过竞争性结合miR-34/miR-449促进AXL和c-MET表达，促进舒尼替尼耐药。                             

    舒尼替尼耐药是晚期肾细胞癌（RCC）的主要挑战。迫切需要了解耐药机制并制定效策略。在这里，我们确定了一种名为lncARSR的lncRNA，与舒尼替尼耐药相关。lncARSR通过竞争性结合miR-34/miR-449促进AXL和c-MET表达，促进舒尼替尼耐药。此外，生物活性lncARSR可以整合到外泌体中并传播到敏感细胞，从而传播舒尼替尼耐药性。                       

    舒尼替尼是一种口服多靶点RTK抑制剂，由于抑制血管内皮生长因子受体（VEGFR），血小板衍生生长因子受体，干细胞生长因子受体和FMS样酪氨酸激酶3，具有有效的抗血管生成作用和直接的抗肿瘤活性。然而，10％-20％的晚期RCC患者本身对舒尼替尼治疗无效，并且大多数剩余患者在治疗6-15个月后最终导致耐药性和肿瘤进展。一些研究表明，通过蛋白质和miRNA的转移，来自基质细胞的外泌体可能潜在地影响治疗反应。然而，需要阐明来自抗性癌细胞的外泌体是否能赋予敏感细胞耐药性。此外，包含在循环外泌体中的成分可作为评估患者药物反应的易于获得的生物标志物。

    通过基于靶向lncARSR的LNA治疗恢复了体内抗性RCC细胞的舒尼替尼反应。此外，AXL/c-MET抑制剂的施用克服了内在和适应性舒尼替尼耐药性，表明舒尼替尼治疗与舒尼替尼难治性RCC患者中的AXL/c-MET抑制剂的临床组合。                             

    为了获得舒尼替尼耐药的RCC细胞，我们将786-O和ACHN细胞移植到裸鼠中并进行舒尼替尼治疗的循环以及体内连续传代。来自第三代的RCC异种移植物显示对舒尼替尼治疗的不良反应和组成型激活的STAT3，AKT和ERK。从这些异种移植物中分离出抗性RCC细胞，分别命名为7Su3rd和ACSu3rd。三轮筛查lncRNA。首先，利用lncRNA微阵列比较亲代和抗性细胞lncRNA表达谱。热图显示了亲代和抗性细胞之间的明显区别（图1B，左图）。qRT-PCR对67个表达差异大的lncRNA（倍数变化>5）进行验证。第三，通过RNAi对8种选择的lncRNA进行舒尼替尼抗性RCC细胞的功能丧失分析。值得注意的是，lncRNARP11-375O18.2-001的干扰（Ensembl：ENST00000424980）与其余7种lncRNA相比，抑制舒尼替尼耐药。通过RACE测定确定lncARSR位于人类的9号染色体上，由4个外显子组成，全长591nt。通过编码潜力分析证实了lncARSR的非编码特性。

    我们接下来研究了舒尼替尼耐药RCC细胞中lncARSR上调的潜在机制。DNA甲基转移酶的抑制对RCC细胞中的lncARSR表达没有影响。lncARSR的启动子区域（2000至200bp）的生物信息学分析预测了FOXO1和FOXO3a的三种DNA结合元件（DBE）。高表达FOXO1（FOXO1-A3）或FOXO3a（FOXO3a-A3）的转染显著下调舒尼替尼耐药细胞中的lncARSR水平。组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A和丁酸钠消除了FOXO1或FOXO3a触发的lncARSR转录抑制，表明FOXO1和FOXO3a可能通过募集组蛋白去乙酰化酶作为转录抑制因子，与之前的报道一致。

    先前报道，激活的AKT可以诱导FOXO家族的磷酸化和细胞质保留，从而进行蛋白酶体降解。实际上，在舒尼替尼抗性细胞中敲低AKT抑制了lncARSR表达并增加了核易位和FOXO1和FOXO3a的表达。总的来说，这些数据表明，激活的AKT对FOXO1和FOXO3a的抑制作用至少部分导致了舒尼替尼耐药的RCC细胞中lncARSR的上调。

    为了进一步阐明lncARSR在舒尼替尼耐药中的功能作用，我们稳定地敲低了lncARSR。抗性细胞中lncARSR的敲低导致舒尼替尼治疗后IC₅₀显著降低和抑制非锚定依赖性生长。在sunitinib治疗后，抗性细胞中的lncARSR敲低导致STAT3，AKT和ERK信号传导的有效抑制和增加的聚（ADP核糖）聚合酶切割，表明抑制lncARSR恢复了对抗性细胞的舒尼替尼反应。

    为了检查lncARSR是否可能存在于细胞外环境中，我们在RCC细胞的培养基（CM）和RCC患者的血浆中提取RNA。RCC患者的血浆lncARSR水平增加。此外，肿瘤切除后血浆lncARSR水平降低，肿瘤复发后再次升高，表明血浆lncARSR主要由肿瘤细胞产生。与舒尼替尼耐药细胞中lncARSR的上调一致，抗性细胞的CM中的lncARSR水平显著高于亲代细胞中的水平。

    我们接下来探讨了循环lncARSR是否可以预测RCC患者的舒尼替尼反应。在舒尼替尼治疗期间患有进行性疾病（PD）的患者中，治疗前血浆中的lncARSR的平均水平高于没有PD的患者（非PD）。此外，Kaplan-Meier分析显示，治疗前血浆中的高lncARSR水平与舒尼替尼治疗的RCC患者的无进展生存期（PFS）降低相关。这种相关性在转移性环境中甚至更显著。

    我们接下来研究了细胞外lncARSR的现有模式。CM中的lncARSR水平在RNase处理时没有变化，但当同时用RNase和TritonX-100处理时显著降低，表明细胞外lncARSR主要由膜包裹而不是直接释放。然后我们从CM中纯化外泌体并通过外泌体标记TSG101和CD9确认它们的特性。有趣的是，外泌体中的lncARSR水平几乎与整个CM中的水平相等，表明外泌体是细胞外lncARSR的主要载体。从舒尼替尼抗性和亲代RCC细胞分离的外泌体显示出相似的典型杯形形态，大小和数量。如所预期的，在舒尼替尼抗性RCC细胞中外泌体lncARSR水平显著高于亲代细胞。

    我们进一步检查了外泌体转移的lncARSR是否可以将抗性表型赋予受体RCC细胞。在共培养集落形成测定中，当与RFP标记的舒尼替尼抗性细胞共培养时，GFP标记的亲代细胞变得对舒尼替尼不敏感，而亲代细胞中的lncARSR敲低消除了这种效应。为了探究外泌体是否在这种作用中发挥关键作用，我们通过RNAi干扰RAB27A/B表达或使用GW4869对中性鞘磷脂酶-2（nSMase）进行药理学抑制来减少外泌体的产生。如图S4G所示，在RAB27A/B敲低或nSMase抑制后，CM中的外泌体数量显著减少，而对细胞活力和细胞内lncARSR水平没有影响。重要的是，来自7Su3rd细胞的具有RAB27A/B敲低或GW4869处理的CM未能赋予对受体细胞的舒尼替尼抗性，表明外泌体对于转移抗性的关键作用。为了证明外泌体lncARSR对体内舒尼替尼反应的影响，我们将来自舒尼替尼抗性和亲代细胞的外泌体瘤内注射到786-O异种移植物中。伴随着肿瘤中lncARSR表达的增加，来自舒尼替尼抗性细胞而非亲代细胞的外泌体显著抑制了RCC异种移植物对舒尼替尼的反应。

    我们进一步寻求鉴定lncARSR驱动的舒尼替尼耐药的介质。越来越多的证据表明激活替代性RTK作为耐药性中的关键角色。因此，我们在抗性细胞中筛选了多个RTK，并发现lncARSR敲低在其磷酸化水平以及mRNA和蛋白质表达上可重复地降低AXL和c-MET。一致地，在舒尼替尼抗性异种移植物和舒尼替尼治疗后临床复发的肿瘤中观察到AXL和c-MET的高表达。我们接下来确定AXL和c-MET是否功能性地参与lncARSR介导的舒尼替尼耐药。AXL和c-MET的恢复在lncARSR敲低抗性细胞中重现了舒尼替尼抗性表型和下游信号传导。相反，AXL和c-MET的同时敲低在生存力和下游信号传导方面消除了lncARSR介导的舒尼替尼抗性，而单独敲低每种都具有有限的作用。

    由于lncARSR主要定位于细胞质中，它可能作为竞争性内源RNA起到隔离miRNA的作用，从而导致相应的miRNA靶向转录物的释放。为了验证这一假设，我们首先用Dicer特异性siRNA转染786-O细胞以有效阻断miRNA生物合成。有趣的是，当敲低Dicer时，lncARSR介导的AXL和c-MET的上调被消除。TargetScan和Miranda分析揭示了由lncARSR和AXL和c-MET的3'UTR共享的miR-34和miR-449的四个推定的miRNA反应元件（MRE）。有趣的是，miR-34和miR-449在结构上相关并且共享相同的“种子”序列。MRE位于lncARSR序列的相对短的跨度中（位置300-400nt）。此外，每个舒尼替尼抗性细胞检测到可比较的拷贝数lncARSR和miR-34/449，这对于ceRNA-miRNA的相互作用是重要的。荧光素酶活性数据证明lncARSR含有功能性miR-34和miR-449结合位点。此外，用miR-34a海绵抑制miR-34和miR-449足以在lncARSR敲低后恢复舒尼替尼抗性。相反，引入miR-34模拟物消除了lncARSR介导的舒尼替尼抗性。

    为了评估lncARSR在体内舒尼替尼耐药性RCC中的治疗潜力，我们在771R-Rluc细胞的原位异种移植物模型中系统地施用靶向lncARSR的优化LNA。生物发光成像显示，治疗性lncARSRLNA有效地恢复了771R-Rluc异种移植物对并发舒尼替尼治疗的敏感性）。28天后停止治疗，但即使在2个月后，在联合治疗组中也未观察到肿瘤再生。

    此外，我们评估了来自RCC患者的PDX模型中lncARSR阻断的治疗潜力，所述RCC患者获得对舒尼替尼的部分反应但在获得性抗性的13个月后复发。靶向lncARSR的LNA将PDX R1重新敏化为舒尼替尼治疗，伴随治疗后肿瘤中lncARSR和AXL/c-MET水平的降低。而且，在治疗期间没有观察到显著的小鼠体重减轻。这些结果表明，体内靶向lncARSR可以恢复RCC的舒尼替尼反应。                          

    对舒尼替尼产生耐药性的晚期RCC患者目前在临床上的治疗选择有限。在这项研究中，我们发现了一种未表征的lncRNA，lncARSR在舒尼替尼耐药的RCC中高度表达，并且对抗性表型具有功能性。lncARSR通过竞争性结合miR-34和miR-449促进舒尼替尼耐药，导致AXL/c-MET的上调和STAT3，AKT和ERK信号传导的激活。

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