Long noncoding RNA LINC01234 functions as a competing endogenous RNA to regulate CBFB expression by sponging miR-204-5p in gastric cancer

Long noncoding RNA LINC01234 functions as a competing endogenous RNA to regulate CBFB expression by sponging miR-204-5p in gastric cancer

长链非编码RNA LINC01234作为竞争性内源RNA起作用，通过海马中miR-204-5p的表达来调节CBFB的表达

期刊：Clinical Cancer Research；影响因子：10.199   

发表单位：南京医科大学                                 

    细胞质中表达的lncRNA常见的作用机制是结合miRNA进而调控靶基因发挥ceRNA机制，上一篇微文“这篇lncRNA ceRNA机制如何发到 IF12分的”介绍了lncRNA MAR1可作为miR-487b海绵吸附调节Wnt5a蛋白，从而促进肌肉分化和再生（IF：12.511），本次继续加深理解。ceRNA研究思路比较清楚，找到重要的lncRNA，确定其细胞定位（细胞质），软件预测结合的miRNA，而后预测miRNA结合的靶基因。正在做lncRNA，ceRNA机制的老师常会发现，软件预测的miRNA, mRNA非常之多。如果可以借助其他数据（也可自己筛选），筛选出差异表达的miRNA，mRNA，而后选择，将更有针对性。本研究将数据库资源运用的好，如何使用已有资料，也可参考“重磅: TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA数据挖掘（含分析结果）”。

    目的：长链非编码RNA（lncRNA）已成为多种人类疾病（包括癌症）的重要调节因子。然而，大多数lncRNA在胃癌发生中的整体生物学作用和临床意义尚不完全清楚。

    实验设计：首先，我们通过分析从癌症基因组图谱（TCGA）获得的测序数据，分析了胃癌和癌旁组织中LINC01234的改变。接下来，我们评估了LINC01234对GC细胞增殖和凋亡的影响，以及通过充当ceRNA对miR-204-5p的调节。动物模型用于支持体外实验结果。

    结果：我们发现LINC01234在胃癌组织中的表达显著上调，并且与较大的肿瘤大小，晚期TNM分期，淋巴结转移和较短的存活时间相关。此外，LINC01234的敲低在体外诱导细胞凋亡和生长停滞，并抑制小鼠异种移植物中的肿瘤发生。机理研究表明，LINC01234作为miR-204-5p的ceRNA起作用，从而导致其内源性靶核心结合因子β（CBFB）的去阻遏。 

    结论：LINC01234在GC中显著过表达，LINC01234-miR-204-5p-CBFB轴在GC肿瘤发生中起关键作用。我们的研究结果可能为胃癌诊断和治疗提供潜在的新靶点。

    由于高发病率和缺乏有效疗法的结合，胃癌是全球癌症相关死亡的主要原因。   

    长链非编码RNA（lncRNA）是一类ncRNA，其转录长度超过200个核苷酸。大量研究发现lncRNA参与了几个重要的细胞生物学过程，包括X染色体印记，干细胞分化，免疫反应，癌细胞增殖和化疗耐药。通常，lncRNA通过调节表观遗传，转录和转录后水平的潜在靶基因表达来发挥其功能。过表达的lncRNA LINC00673通过海绵吸附miR-150-5p促进非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和上皮间质转化。HOTAIR还通过作为miR-126的竞争性内源性RNA（ceRNA）起作用来调节胃癌中的顺铂耐药性。在本研究中，我们鉴定了一种位于12q24.13的新的与胃癌相关的lncRNA LINC01234，尚未发现LINC01234在癌症中的生物学功能和表达模式。

    为了鉴定可能涉及胃肿瘤发生的胃癌相关的lncRNA，我们分析TCGA的376个STAD组织（肿瘤组）和33个相邻的非肿瘤组织（正常组）的RNA测序数据。结果，我们发现LINC01234在肿瘤组织中的表达水平显著高于非肿瘤组织（图1A）。然后，从GEO中分析另外三个基因谱分析数据（GSE13911，GSE70880和GSE99416）证实，与正常组织相比，LINC01234在胃癌组织中高表达（补充图1A）。原位杂交（ISH）测定也显示胃癌组织显示LINC01234高表达（图1B）。此外，qRT-PCR测量50对胃癌组织，胃癌细胞系（BGC823，SGC7901，MGC803，AGS和HGC27）和正常胃上皮细胞GES-1中LINC01234的表达水平。结果显示，胃癌组织和癌细胞中LINC01234的表达显著增加（图1C和D）。

    为了评估LINC01234临床意义，与患者临床病理学特征之间的相关性。将50名患者分析显示高LINC01234表达与较大肿瘤大小（P = 0.047），侵袭深度（P = 0.021 *）和淋巴结转移（P = 0.009）和TNM分期（P = 0.031 *）显著相关。Kaplan-Meier分析显示，LINC01234水平较高的患者的总生存期和无进展生存期短于LINC01234水平较低的患者（图1E和F）。

    为了研究LINC01234在胃癌细胞中的生物学功能，我们通过用siRNA，短发夹RNA（shRNA）载体或过表达质粒转染，在SGC7901和BGC823细胞中敲低或过表达LINC01234（图2A和B）。由CCK8增殖测定产生的生长曲线显示LINC01234敲低显著抑制SGC7901和BGC823细胞增殖，而LINC01234过表达促进SGC7901和BGC823细胞生长能力。

    细胞凋亡增加和细胞周期停滞是导致癌细胞增殖的两个因素。流式细胞仪检测和Tunel染色显示si-LINC01234转染的SGC7901和BGC823细胞也显示细胞周期停滞。与用乱序siRNA转染的细胞相比，显著更多的细胞处于G1/G0期，并且更少的细胞处于细胞周期的G2/S期。此外，耗尽LINC01234的细胞表达显著更高水平的凋亡相关蛋白，包括切割的Caspase-3，切割的PARP，Bak和Bax。

    为了确定LINC01234是否影响体内肿瘤生长，用对照载体或靶向LINC01234的shRNA稳定转染SGC7901细胞，并皮下接种到雄性裸鼠中。由表达sh-LINC01234的细胞产生的肿瘤的平均大小和重量显著小于从对照细胞产生的肿瘤。sh-LINC01234肿瘤中增殖标志物Ki-67的表达低于对照肿瘤。Tunel染色显示，sh-LINC0123肿瘤表现出更多的凋亡细胞。总之，这些结果证实了LINC01234在体内胃癌中的致癌活性。

    近期的研究表明，lncRNAs可以作为miRNA的ceRNAs来调节靶基因的表达。为了研究LINC01234促进胃癌细胞增殖的分子机制，我们首先使用FISH和亚细胞分离分析其分布。结果显示LINC01234在细胞质中更丰富，表明LINC01234可能在转录后调节靶标表达。实际上，胃癌细胞提取物的RNA结合蛋白免疫沉淀测定显示LINC01234直接结合Ago2，Ago2是参与miRNA介导的mRNA抑制的RNA诱导的沉默复合物的组分。该发现表明LINC01234可以作为miRNA的ceRNA起作用。为了确定这一假设，我们使用在线生物信息学数据库（DIANA Tools）并观察到LINC01234序列含有潜在的miR-148a-5p，miR-204-5p，miR-30d-3p，miR-33b-5p，miR-29c-5p和miR-193a-5p结合位点。然后我们进行双荧光素酶报告分析以确认预测分析。miR-204-5p的抑制荧光能力更强。然后，GEO、TCGA miRNA分析，发现miR-204-5p，miR-30d-3p，miR-33b-5p和miR-29c-5p在胃组织中下调，并且miR-204-5p显示出最高的倍数变化。值得注意的是，LINC01234敲低显著增加了miR-204-5p的表达水平（图4G），然而，miR-204-5p的过表达对LINC01234表达水平没有影响。

    为了确定miR-204-5p是否在胃癌细胞中起肿瘤抑制剂的作用，发现miR-204-5p过表达显著降低细胞增殖和集落形成能力，miR-204-5p低表达时显著增强。此外，流式细胞术分析显示miR-204-5p的过表达诱导SGC7901和BGC823细胞中G1-G0期的细胞凋亡和细胞周期停滞。此外，Kaplan-Meier生存分析显示miR-204-5p水平较高的患者总生存期较低水平。此外，miR-204-5p的过表达抑制了体内胃癌细胞的肿瘤生长。

    为了确定LINC01234，miR-204-5p及其在胃癌中的靶标之间的ceRNA网络，我们使用TargetScan和miRanda来预测潜在的miR-204-5p靶基因。接下来，TCGA数据预测LINC01234-miR-204-5p靶向ceRNA网络，并发现CBFB，UBA2等基因可能涉及该网络。然后，我们对LINC01234下调SGC7901细胞的基因表达进行了RNA-seq分析，结果表明，敲低LINC01234可明显降低一系列促进胃癌增殖的基因。有趣的是，CBFB是最常改变基因之一，因此选择CBFB用于胃癌的进一步分析。计算机分析显示CBFB的3'UTR（2131-2151个核苷酸）含有潜在的miR-204-5p结合位点。

    由于LINC01234可以结合miR-204-5p，我们接下来确定LINC01234是否可以通过结合miR-204-5p中的相同位点来调节CBFB的表达。我们发现LINC01234的敲低也显著降低了SGC7901和BGC823细胞中的CBFB mRNA和蛋白质水平。miR-204-5p抑制剂有效地逆转了由si-LINC01234 2＃引起的CBFB蛋白水平的抑制。然后，分析20对胃癌组织中LINC01234和CBFB表达之间的相关性，发现LINC01234和CBFB之间存在正相关，与LINC01234-miR-204-5p-CBFB调节轴的存在一致。

    为了研究CBFB在胃癌中的致癌作用，我们首先分析了其在胃癌和癌旁组织中的表达。结果显示，通过TCGA测序数据分析，CBFB在胃癌样品中比癌旁组织增加。类似地，人胃癌组织的免疫组织化学染色显示胃癌样品中CBFB蛋白丰度增加。重要的是，较高的CBFB表达与胃癌患者较短的总生存时间显著相关。CBFB表达的敲低显著降低细胞生长活力。此外，CBFB的敲低可抑制体内胃癌细胞的肿瘤生长。

    越来越多的报道表明存在一个涉及ceRNA的新型和广泛的相互作用网络，其中lncRNA可以通过结合miRNA并将其从蛋白质编码mRNA结合位点分离。例如，lncRNA HOXA11-AS通过作为miR-1297的ceRNA而促进胃癌细胞增殖; lncRNA Unigene56159通过作为miR-140-5p的ceRNA促进肝细胞癌细胞侵袭和上皮-间质转化。在这项研究中，我们确定LINC01234主要定位于细胞质中并且可以与胃癌细胞中的Ago2相互作用，这表明LINC01234可以作为内源miRNA起海绵吸附作用。

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