A newly identified lncRNA MAR1 acts as a miR-487b sponge to promote skeletal muscle differentiation and regeneration

A newly identified lncRNA MAR1 acts as a miR-487b sponge to promote skeletal muscle differentiation and regeneration

新鉴定的lncRNA MAR1充当miR-487b海绵吸附，促进骨骼肌分化和再生

期刊：J Cachexia Sarcopenia Muscle；影响因子：12.511

发表单位：香港中文大学

    lncRNA/circRNA等可以作为竞争性内源RNA起到海绵吸附miRNA进而减弱miRNA对其靶基因的抑制作用。研究ceRNA机制，通过测序或芯片找到差异的重要的lnc/circ（除了做实验，还可以怎么找？），预测其结合的miRNA，预测miRNA结合的靶基因（小注：该靶基因一定要在该生物学中发挥重要作用，是转录因子等调控分子，影响力大）。该文章是lncRNA ceRNA机制研究很好的范本。

    背景：老化（肌肉减少症）或力学失负荷引起的骨骼肌萎缩与严重的健康后果相关。长链非编码RNA（lncRNA）被认为是许多生理和病理过程中的重要调节剂。

    方法：进行微阵列分析以鉴定成年和老年小鼠之间骨骼肌中差异表达的lncRNA。通过生物信息学分析预测lncRNA的靶microRNA和microRNA的靶蛋白，并在体外进行验证。此外，通过过表达或敲低lncRNA来研究体内lncRNA的生物学功能。评估了lncRNA过表达在年龄相关或力学失负荷导致的肌肉萎缩中的治疗效果。

    结果：一种新lncRNA MAR1在小鼠骨骼肌中高表达，microRNA-487b（miR-487b）是MAR1的直接靶标。Wnt5a，一种在肌生成过程中的重要调节因子，是C2C12细胞中miR-487b的靶标。结果证明，成肌细胞中MAR1的过表达导致Wnt5a的去阻遏。此外，MAR1促进骨骼肌质量/强度和Wnt5a蛋白水平。MAR1过表达减弱了由衰老或去负荷诱导的肌肉萎缩。

    结论：新鉴定的lncRNA MAR1可作为miR-487b海绵吸附调节Wnt5a蛋白，从而促进肌肉分化和再生。 MAR1可能是治疗老化或力学失负荷引起的肌肉萎缩的新型治疗靶点。

    骨骼肌分化受多种信号传导通路的影响。肌源性调节因子（MRFs），包括MyoD，Myf5和肌细胞生成素，是肌源性通路的核心成分，这些MRF及其共调节因子肌细胞增强因子2C（MEF2C）在肌肉生成过程中起重要作用。Wingless型（Wnt）信号控制MRFs的表达。Wnt5a是Wnt家族成员，在肌细胞生成过程中调节MyoD和Myf5。但是，骨骼肌萎缩的分子机制仍需要进行广泛的探索。lncRNAs在骨骼肌萎缩中的病理作用，特别是由衰老或力学失负荷引起的，仍然是未知的。本研究目的是探讨lncRNA在由衰老或力学失负荷诱导的骨骼肌萎缩期间调节肌肉分化中的作用。

    利用lncRNA微阵列比较成年（6个月大，n = 3）和老年小鼠（24个月大，n = 3）之间腓肠肌中差异表达的lncRNA。641nt长的lncRNA（AK087875）被鉴定为下调低的lncRNA。将此lncRNA命名为MAR1。PCR显示，在成年小鼠中，骨骼肌中MAR1的表达水平远高于其他组织/器官中的表达水平（n = 10）（图1B）。在不同的骨骼肌中，腓肠肌中的MAR1是丰富的（图1C）。相关性分析显示，肌肉生长和衰老过程中MAR1表达与M/B比值呈正相关（图1F）。此外，骨骼肌中MAR1的表达水平在力学失负荷期间下调并且在重新负荷期间恢复（n = 10）（图1G）。在失负荷和重新负荷的小鼠中，M/B比率显示与MAR1的表达水平类似的变化模式（图1H）。相关性分析还显示当力学负荷改变时MAR1水平和M/B比之间正相关（图1I）。

    在C2C12成肌细胞的肌原性分化期间MAR1增加，这与肌原性标志物（MyoD和MyoG）的表达水平的变化一致。我们构建了编码MAR1或MAR1 shRNA的慢病毒载体。在C2C12细胞中过表达MAR1显著增强肌原性标记物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）的mRNA和蛋白质水平以及肌管的形成，而MAR1 shRNA降低了上述mRNA和蛋白质水平以及肌管的形成。

    为了进一步了解MAR1调节肌肉分化的机制，使用RNAhybrid 2.12预测microRNA-487b是MAR1的靶miRNA之一。进一步揭示生物素标记的MAR1在miR-487b转染的C2C12细胞中以剂量依赖性方式特异性地降低miR-487b。然后，我们将含有野生型结合位点（miR-487b-WT）或突变结合位点（miR-487b-Mut）的miR-487b克隆到荧光素酶报告基因的下游。结果表明，MAR1转染可降低miR-487b-WT的荧光素酶活性，但不影响miR-487b-Mut的荧光素酶活性。同时，含有突变结合位点的MAR1的转染不能降低miR-487b-WT或miR-487b-Mut的荧光素酶活性。

    Wnt5a是生肌过程中的重要调节因子，被报道为肺癌细胞中miR-487b的靶标之一。在CaC5细胞中，Wnt5a通过agomiR-487b（miR-487b激动剂）在蛋白质水平下调，而antagomiR-487b（miR-487b抑制剂）使Wnt5a蛋白表达升高。通过RNAhybrid 2.12预测Wnt5a在其3'非翻译区（UTR）中具有miR-487b结合位点。我们构建了荧光素酶报告基因。荧光素酶报告基因测定显示agomiR-487b（含有Wnt5a野生型结合位点的agomiR-487b），可降低Wnt5a 3'UTR的荧光素酶活性，但含agomiR-487b-Mut（含有Wnt5a突变结合位点的agomiR-487b）的不能 。

    我们发现在C2C12细胞中肌肉分化期间Wnt5a蛋白质增加。相关性分析显示，在分化期间，Wnt5a蛋白的表达水平与C2C12细胞中的MAR1水平正相关。在C2C12细胞中MAR1过表达显著增强Wnt5a蛋白表达，而agomiR-487b可以消除升高的Wnt5a蛋白表达。MAR1 shRNA感染降低了C2C12细胞中Wnt5a蛋白的表达，并且antagomiR-487b可以挽救Wnt5a蛋白表达的减少。

    我们通过肌肉注射肌肉特异性MAR1过表达或低表达慢病毒进一步操纵成年小鼠（n = 10）中的MAR1表达。MAR1过表达增强了腓肠肌质量和肌纤维CSA。与对照组相比，MAR1过表达小鼠的肌肉也产生显著更高的力。此外，MAR1过表达小鼠的肌肉中肌原性标志物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）蛋白，Wnt5a蛋白，mRNA的表达水平升高。另一方面，腓肠肌中的MAR1 shRNA感染减少了肌肉量和纤维CSA。在MAR1 shRNA感染后，肌肉产生的力也被抑制。此外，MAR1 shRNA感染下调小鼠肌肉中Wnt5a蛋白，mRNA，肌原性标志物的蛋白水平。

    为了测试骨骼肌中MAR1过表达是否可以抵消与年龄相关的肌肉萎缩，22个月大的小鼠肌内注射肌肉特异性MAR1过表达慢病毒。与基线和年龄匹配的对照组相比，MAR1过表达组中MAR1的表达水平显著更高。老年组腓肠肌质量和平均肌纤维CSA均较基线组降低，而MAR1组则增强。此外，我们进行了原位肌肉功能测试。结果显示，老年组腓肠肌的强度比基线组弱，而MAR1组产生的力比其他两组高。此外，Wnt5a蛋白水平，mRNA和肌原性标志物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）蛋白水平显示出与肌肉质量和强度参数相似的变化。

    小鼠在28天HS之前肌内注射肌肉特异性MAR1过表达慢病毒。在28天HS后，HS组的MAR1水平显著低于基线组，而MAR1组的MAR1水平略高于基线组。MAR1组的肌肉质量和平均肌纤维CSA显著高于HS组，接近基线组水平。原位肌肉功能测试的结果显示，MAR1组中力学失负荷诱导的肌肉无力有效减弱。类似地，MAR1组恢复了降低的Wnt5a蛋白水平、mRNA和肌源性标志物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）的蛋白质水平。

    在这项研究中，我们在小鼠骨骼肌中鉴定出一种新的lncRNA MAR1，起到促进骨骼肌分化和再生的miR-487b海绵吸附的作用，这可能是治疗由衰老或力学失负荷引起的肌肉萎缩的新型治疗靶点。已经报道了一种新的调节机制，其中lncRNA可以作为竞争性内源RNA起到海绵吸附miRNA的作用，从而调节miRNA靶标的去阻遏并施加额外水平的转录后调控。在目前的研究中，当MAR1在C2C12细胞中被敲低或过表达时，miR-487b的表达被上调或下调，导致Wnt5a蛋白水平和肌生成分别降低或增加。这些数据表明MAR1可能与miR-487b相互作用以转录后调节Wnt5a蛋白。

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