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The lncRNA CASC9 and RNA binding protein HNRNPL form a complex and co-regulate genes linked to AKT signaling

文字:[大][中][小] 2018/10/25     浏览次数:    

The lncRNA CASC9 and RNA binding protein HNRNPL form a complex and co-regulate genes linked to AKT signaling

lncRNA CASC9RNA结合蛋白HNRNPL形成与AKT信号传导相关的复合和共调节基因


期刊Hepatology影响因子:1

发表单位:海德堡大学     


导 读


    寻找与细胞活力相关的lncRNA,常见方法是先获取高活力的细胞和低活力的细胞,而后lncRNA测序或芯片筛选,本研究在肝癌细胞系中,设计了针对638癌相关的lncRNA siRNA库,而后处理细胞,筛选活力显著变化处理组确定发挥功能的lncRNA,而后进行敲低实验,结合TCGA等临床数据分析验证其功能。


摘 要

    研究细胞活力相关的lncRNA可能是肝癌新治疗方法之一。在这里,我们在肝细胞癌(HCC)细胞系中应用了RNAi筛选方法来寻找与细胞活力相关的lncRNA。我们发现CASC9,其表型,表达在HCC中变化显著。CASC9降低导致细胞凋亡增加和增殖减少。RNA亲和纯化鉴定RNA结合蛋白异质核核糖核蛋白LHNRNPL)作为CASC9相互作用蛋白。HNRNPL的敲减重现了CASC9降低时观察到的活力丧失。蛋白质组分析暗示CASC9HNRNPL复合物在AKT-signalingDNA damage sensing中的作用。肿瘤中CASC9表达水平升高,并且与HCC患者的总体存活率显著相关敲低CASC9后肿瘤尺寸的减小


研究背景

    大多数人类基因是ncRNA基因,而不是蛋白质编码基因。因此,ncRNA基因,特别是长的非编码RNAlncRNA)基因,在过去几年中得到了强烈的研究,可能与各种生理和病理功能有关,包括肝癌发生。

通常,lncRNA通过与细胞核或细胞质中的蛋白质的直接相互作用发挥其功能。在细胞核中,lncRNA可以作为调节转录因子或表观遗传调节因子的靶向特异性的引导。在细胞质中,lncRNA参与转录后调控,例如,基因表达,RNA稳定性或翻译。比如DANCR结合CTNNB1的3非翻译区并阻断miRNA结合位点,而UFC1通过将RNA结合蛋白ELAVL1HuR)募集至CTNNB1而起作用。在这项研究中,我们旨在识别HCC中与活力相关的lncRNAs。为此,我们使用定制的RNAi文库,该文库靶向638个癌症相关的lncRNA


研究方法

    siRNA文库,筛选和验证:如前所述涉及靶向638个潜在致癌的lncRNA> 3100siRNA组成的siRNA文库。在生长培养基中384孔板中进行逆转染。为了验证,潜在的lncRNA重新分配siRNA并如上所述进行转染。用HTS2 R包分析数据,挑选活力变化较大的lncRNA进行后续分析。


研究结果

1siRNA筛选与细胞活力相关lncRNA

    通过基于微阵列32肿瘤样本与7正常肝脏样品分析HCClncRNA表达。为了获得与癌症相关lncRNA,设计siRNA文库,探讨lncRNA在癌症中的应用。总共产生638个显著失调的lncRNA,大多数是上调的。转染72小时,用基于发光的测定法测量活力。活力增加高的基因是MIR217,它是肿瘤抑制性miRNA宿主基因(图1B),宿主lncRNA功能研究参考“宿主lncRNA与miRNA是否有关系呢?”。我们评估了具有高活力降低前50个基因,并排除了非lncRNA。通过RT-qPCR分析剩余的21lncRNA5HCC细胞系(HLEHLFHuh-7HepG2PLC)中的基础表达,并与正常肝组织进行差异表达,以及通过编码潜力评估工具(CPAT)评分来确定编码能力。LncRNA CASC9显示所有四个参数的佳组合:CASC9缺失具有强表型,其表达在所有被测试的HCC细胞系中均可检测到,其在HCC肿瘤样本表达上调,并且显示出非常低的编码概率


2CASC9调节HCC细胞的增殖和诱导细胞凋亡

    单个siRNA可能引起脱靶效应,siPOOL技术使用30个单一siRNA靶向一个基因,每个siRNA浓度非常低,从而有效地减弱潜在的脱靶效应。

与用靶向CASC9的单个siRNA处理后观察到的结果一致,我们在HLE-31%)和 Huh-7-22%)中的使用靶向CASC9siCASC9)的siPOOLs观察到相同的活力丧失表现。在总共11个细胞系的8个中CASC9敲低后活力显著降低。为了阐明活力丧失是由代谢变化还是增殖缺陷引起,使用BrdU测定来评估HLESNU-387细胞的增殖速率。两种细胞系中的增殖率都显著降低超过25%。


3CASC9是广泛表达的细胞质长链非编码RNA

    接下来,进一步研究CASC9基因及其产物。根据EnsemblCASC9基因有五个外显子,有四种同种型。qPCR显示CASC9-004HLESNU-387细胞中丰富的同种型,分别占总转录物的72%和40%。我们关注丰富的同种型CASC9-004,其被称为CASC9通过RT-qPCR测试一组73个不同来源的人细胞系(主要是癌细胞系)的CASC9表达水平。CASC9在来自不同组织和癌症实体的各种细胞系中广泛表达,在源自非小细胞肺癌和胰腺癌或宫颈癌的细胞系中具有与HCC细胞系相似的表达用三种计算机工具预测CASC9的编码概率,即CPATCPCPhyloCSFCASC9CPATCPC得分与MALAT1等成熟的非编码RNA一样低。此外,PhyloCSF没有高密码子保守区域,表明CASC9的非编码性质亚细胞定位分析显示两种CASC9同种型主要定位于细胞质中,表明其在细胞质中的主要作用。


4CASC9与异质核核糖核蛋白L结合

    为了阐明CASC9和潜在结合的蛋白质,进行了RNA亲和纯化(RAP)实验。检测到CASC9泳道中约65kDa的特定条带。质谱法鉴定,异构核核糖核蛋白LHNRNPL)出现在列表的顶部

此外,我们通过逆实验方法验证了CASC9HNRNPL的相互作用,即HLE细胞中的天然RNA免疫沉淀(RIP)方法。与IgG-RIP样品相比,HNRNPL-RIPCASC9显著富集约300,而HuR-RIPCASC9的富集低10倍。相反,与IgG-RIP相比,MALAT1HuR-RIP中显示出超过300倍的显著富集(图4F)。


5CASC9HNRNPL调节与减少AKT信号传导和增加DNA损伤激活相关的一组联合靶基因的表达

    为了检查CASC9HNRNPL的潜在功能,我们使用siPOOLsHLE细胞中进行了HNRNPL的敲低。HNRNPL mRNA的敲低效率为95%,HNRNPL蛋白的敲低效率为66%。HNRNPL的敲低显示出显著的30%生存力降低,在效果,方向和程度方面模拟了CASC9敲低的活力丧失表现。HNRNPL主要定位于细胞核并参与RNA的转录,剪接和加工为了鉴定CASC9HNRNPL的缺失导致共同异常表达的基因,我们用HLE细胞中的细胞培养物(SILAC)中的氨基酸进行了稳定同位素标记,比较了CASC9HNRNPL的敲低引起基因的变化。299蛋白质上调和248个下调。CASC9敲低对HNRNPL mRNA或蛋白质水平都没有强烈影响,也没有对CASC9表达的HNRNPL敲低。IPA分析显示侵袭和粘附相关通路的减少,例如,整合素和CDC42-信号传导以及增殖和活力通路如PI3K/AKTERK信号传导通路。在调控网络分析中,AKT1CASC9列表以及单独的HNRNPL敲低中重要的调节分子。

该发现说明了CASC9HNRNPL复合物可能通过影响PI3K / AKT信号级联来调节HCC细胞活力的假设。为了测试该假设,CASC9HNRNPL敲低后分析AKT的磷酸化(p-AKT)和总PTEN水平。通过使用丝氨酸473磷酸特异性抗体,在siCASC9-siHNRNPL-处理的HLE细胞中检测到p-AKT水平的显著降低,其是AKT-信号传导活性的指示物。相反,PTEN的蛋白质水平基本保持不变SILAC数据集的检查显示,102个共同调节基因中的23DNA损伤感应/反应通路相关,这进一步支持了CASC9HNRNPL复合物可能参与DNA损伤传感/响应的调节的假设。


6CASC9是临床相关的lncRNACASC9减少降低体内肿瘤大小

    分析肝癌基因组图谱CGA数据集中肿瘤与正常样品中CASC9的表达,TCGA数据挖掘可以参考“重磅: TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA数据挖掘(含分析结果)CASC9HCC肿瘤样品中显著更高表达(图6A)。在线资源miTranscriptome显示CASC9不仅在HCC肿瘤中表达,而且在例如肺,膀胱,头颈部和结直肠癌同样表达。生存分析发现HCC中的CASC9表达水平与HCC患者的总体存活相关。在接种CAM之前24小时,使用RNAisiCASC9)在体外进行HLE细胞中的CASC9敲低。在CAM上生长一周后收获肿瘤,测定CASC9敲低和对照siRNA处理的肿瘤的重量。与对照肿瘤相比,肿瘤重量的定量分析显示总肿瘤重量的显著减少49(图6E)。

    

讨 论

    到目前为止,只有少数研究使用基于RNAi的方法来搜索与活力相关的lncRNAs。据我们所知,这项研究是第一项应用功能性siRNA筛查在肝细胞癌中丧失生存力的lncRNAs的研究。筛选结果与其他研究结果非常吻合:已知lncRNA基因HOTAIRLINC00152PVT1HULC对癌细胞存活率很重要。我们发现CASC9减少的影响是由混合表型引起的,包括增殖丧失和诱导细胞凋亡。其他研究将CASC9的细胞表型与EMT和侵袭受损联系起来。然而,之前提出的参与EMTCASC9靶基因如VIMCDH1CDH2SNAI1没有差异表达,这可能表明肿瘤类型特异性差异。


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