The lncRNA CASC9 and RNA binding protein HNRNPL form a complex and co-regulate genes linked to AKT signaling

lncRNA CASC9和RNA结合蛋白HNRNPL形成与AKT信号传导相关的复合和共调节基因

期刊：Hepatology；影响因子：1

发表单位：海德堡大学     

    寻找与细胞活力相关的lncRNA，常见方法是先获取高活力的细胞和低活力的细胞，而后lncRNA测序或芯片筛选，本研究在肝癌细胞系中，设计了针对638癌相关的lncRNA siRNA库，而后处理细胞，筛选活力显著变化处理组确定发挥功能的lncRNA，而后进行敲低实验，结合TCGA等临床数据分析验证其功能。

    研究细胞活力相关的lncRNA可能是肝癌新治疗方法之一。在这里，我们在肝细胞癌（HCC）细胞系中应用了RNAi筛选方法来寻找与细胞活力相关的lncRNA。我们发现CASC9，其表型，表达在HCC中变化显著。CASC9降低导致细胞凋亡增加和增殖减少。RNA亲和纯化鉴定RNA结合蛋白异质核核糖核蛋白L（HNRNPL）作为CASC9相互作用蛋白。HNRNPL的敲减重现了CASC9降低时观察到的活力丧失。蛋白质组分析暗示CASC9：HNRNPL复合物在AKT-signaling和DNA damage sensing中的作用。肿瘤中CASC9表达水平升高，并且与HCC患者的总体存活率显著相关。敲低CASC9后肿瘤尺寸的减小。

    大多数人类基因是ncRNA基因，而不是蛋白质编码基因。因此，ncRNA基因，特别是长的非编码RNA（lncRNA）基因，在过去几年中得到了强烈的研究，可能与各种生理和病理功能有关，包括肝癌发生。

通常，lncRNA通过与细胞核或细胞质中的蛋白质的直接相互作用发挥其功能。在细胞核中，lncRNA可以作为调节转录因子或表观遗传调节因子的靶向特异性的引导。在细胞质中，lncRNA参与转录后调控，例如，基因表达，RNA稳定性或翻译。比如DANCR结合CTNNB1的3’非翻译区并阻断miRNA结合位点，而UFC1通过将RNA结合蛋白ELAVL1（HuR）募集至CTNNB1而起作用。在这项研究中，我们旨在识别HCC中与活力相关的lncRNAs。为此，我们使用定制的RNAi文库，该文库靶向638个癌症相关的lncRNA。

    siRNA文库，筛选和验证：如前所述涉及靶向638个潜在致癌的lncRNA的> 3100个siRNA组成的siRNA文库。在生长培养基中384孔板中进行逆转染。为了验证，潜在的lncRNA重新分配siRNA并如上所述进行转染。用HTS2 R包分析数据，挑选活力变化较大的lncRNA进行后续分析。

    通过基于微阵列32个肿瘤样本与7个正常肝脏样品分析HCC的lncRNA表达谱。为了获得与癌症相关lncRNA，设计siRNA文库，探讨lncRNA在癌症中的应用。总共产生638个显著失调的lncRNA，大多数是上调的。转染72小时，用基于发光的测定法测量活力。活力增加高的基因是MIR217，它是肿瘤抑制性miRNA宿主基因（图1B），宿主lncRNA功能研究参考“宿主lncRNA与miRNA是否有关系呢？”。我们评估了具有高活力降低前50个基因，并排除了非lncRNA。通过RT-qPCR分析剩余的21个lncRNA在5个HCC细胞系（HLE，HLF，Huh-7，HepG2，PLC）中的基础表达，并与正常肝组织进行差异表达，以及通过编码潜力评估工具（CPAT）评分来确定编码能力。LncRNA CASC9显示所有四个参数的佳组合：CASC9缺失具有强表型，其表达在所有被测试的HCC细胞系中均可检测到，其在HCC肿瘤样本表达上调，并且显示出非常低的编码概率。

    单个siRNA可能引起脱靶效应，siPOOL技术使用30个单一siRNA靶向一个基因，每个siRNA浓度非常低，从而有效地减弱潜在的脱靶效应。

与用靶向CASC9的单个siRNA处理后观察到的结果一致，我们在HLE（-31％）和 Huh-7（-22％）中的使用靶向CASC9（siCASC9）的siPOOLs观察到相同的活力丧失表现。在总共11个细胞系的8个中CASC9敲低后活力显著降低。为了阐明活力丧失是由代谢变化还是增殖缺陷引起，使用BrdU测定来评估HLE和SNU-387细胞的增殖速率。两种细胞系中的增殖率都显著降低超过25％。

    接下来，进一步研究CASC9基因及其产物。根据Ensembl，CASC9基因有五个外显子，有四种同种型。qPCR显示CASC9-004是HLE和SNU-387细胞中丰富的同种型，分别占总转录物的72％和40％。我们关注丰富的同种型CASC9-004，其被称为CASC9。通过RT-qPCR测试一组73个不同来源的人细胞系（主要是癌细胞系）的CASC9表达水平。CASC9在来自不同组织和癌症实体的各种细胞系中广泛表达，在源自非小细胞肺癌和胰腺癌或宫颈癌的细胞系中具有与HCC细胞系相似的表达。用三种计算机工具预测CASC9的编码概率，即CPAT，CPC和PhyloCSF。CASC9的CPAT和CPC得分与MALAT1等成熟的非编码RNA一样低。此外，PhyloCSF没有高密码子保守区域，表明CASC9的非编码性质。亚细胞定位分析显示两种CASC9同种型主要定位于细胞质中，表明其在细胞质中的主要作用。

    为了阐明CASC9和潜在结合的蛋白质，进行了RNA亲和纯化（RAP）实验。检测到CASC9泳道中约65kDa的特定条带。质谱法鉴定，异构核核糖核蛋白L（HNRNPL）出现在列表的顶部。

此外，我们通过逆实验方法验证了CASC9和HNRNPL的相互作用，即HLE细胞中的天然RNA免疫沉淀（RIP）方法。与IgG-RIP样品相比，在HNRNPL-RIP中CASC9显著富集约300倍，而HuR-RIP中CASC9的富集低10倍。相反，与IgG-RIP相比，MALAT1在HuR-RIP中显示出超过300倍的显著富集（图4F）。

    为了检查CASC9和HNRNPL的潜在功能，我们使用siPOOLs在HLE细胞中进行了HNRNPL的敲低。HNRNPL mRNA的敲低效率为95％，HNRNPL蛋白的敲低效率为66％。HNRNPL的敲低显示出显著的30％生存力降低，在效果，方向和程度方面模拟了CASC9敲低的活力丧失表现。HNRNPL主要定位于细胞核并参与RNA的转录，剪接和加工。为了鉴定CASC9或HNRNPL的缺失导致共同异常表达的基因，我们用HLE细胞中的细胞培养物（SILAC）中的氨基酸进行了稳定同位素标记，比较了CASC9和HNRNPL的敲低引起基因的变化。299蛋白质上调和248个下调。CASC9敲低对HNRNPL mRNA或蛋白质水平都没有强烈影响，也没有对CASC9表达的HNRNPL敲低。IPA分析显示侵袭和粘附相关通路的减少，例如，整合素和CDC42-信号传导以及增殖和活力通路如PI3K/AKT和ERK信号传导通路。在调控网络分析中，AKT1是CASC9列表以及单独的HNRNPL敲低中重要的调节分子。

该发现说明了CASC9：HNRNPL复合物可能通过影响PI3K / AKT信号级联来调节HCC细胞活力的假设。为了测试该假设，在CASC9和HNRNPL敲低后分析AKT的磷酸化（p-AKT）和总PTEN水平。通过使用丝氨酸473磷酸特异性抗体，在siCASC9-和siHNRNPL-处理的HLE细胞中检测到p-AKT水平的显著降低，其是AKT-信号传导活性的指示物。相反，PTEN的蛋白质水平基本保持不变。对SILAC数据集的检查显示，102个共同调节基因中的23个与DNA损伤感应/反应通路相关，这进一步支持了CASC9：HNRNPL复合物可能参与DNA损伤传感/响应的调节的假设。

    分析肝癌基因组图谱CGA数据集中肿瘤与正常样品中CASC9的表达，TCGA数据挖掘可以参考“重磅: TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA数据挖掘（含分析结果）”。CASC9在HCC肿瘤样品中显著更高表达（图6A）。在线资源miTranscriptome显示CASC9不仅在HCC肿瘤中高表达，而且在例如肺，膀胱，头颈部和结直肠癌同样高表达。生存分析发现HCC中的CASC9表达水平与HCC患者的总体存活相关。在接种CAM之前24小时，使用RNAi（siCASC9）在体外进行HLE细胞中的CASC9敲低。在CAM上生长一周后收获肿瘤，测定CASC9敲低和对照siRNA处理的肿瘤的重量。与对照肿瘤相比，肿瘤重量的定量分析显示总肿瘤重量的显著减少49％（图6E）。

    到目前为止，只有少数研究使用基于RNAi的方法来搜索与活力相关的lncRNAs。据我们所知，这项研究是第一项应用功能性siRNA筛查在肝细胞癌中丧失生存力的lncRNAs的研究。筛选结果与其他研究结果非常吻合：已知lncRNA基因HOTAIR，LINC00152，PVT1和HULC对癌细胞存活率很重要。我们发现CASC9减少的影响是由混合表型引起的，包括增殖丧失和诱导细胞凋亡。其他研究将CASC9的细胞表型与EMT和侵袭受损联系起来。然而，之前提出的参与EMT的CASC9靶基因如VIM，CDH1，CDH2和SNAI1没有差异表达，这可能表明肿瘤类型特异性差异。

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