Expression of long non-coding RNA YIYA promotes glycolysis in breast cancer

长非编码RNA YIYA的表达促进乳腺癌中的糖酵解

    期刊：Cancer Research；影响因子：9.130

前一篇微文我们介绍了lncRNA在精神分裂症患者脑杏仁核区域的表达谱“精神分裂症患者脑杏仁核组织中lncRNA表达谱”。lncRNA在癌中发挥作用报道的很多，然而其调控细胞代谢如糖酵解过程的报道较少，本研究发现lncRNA YIYA可以与CDK6蛋白直接结合，介导PFKFB3的磷酸化，促进糖酵解中葡萄糖代谢，进而促进细胞增殖和肿瘤生长。

长链非编码RNA（lncRNA）尚未在癌代谢领域研究过。在这里，我们报告lncRNA LINC00538（YIYA）的上调促进乳腺癌中的糖酵解，细胞增殖和肿瘤生长。YIYA与细胞质细胞周期蛋白激酶CDK6相关，并以细胞周期非依赖的方式调节果糖二磷酸酶PFK2（PFKFB3）的CDK6依赖性磷酸化。在乳腺癌细胞中，这些事件促进葡萄糖6-磷酸催化成果糖-2,6-二磷酸酯/果糖-1,6-二磷酸酯。

一种名为YIYA的长非编码RNA被证明在多种癌症类型中被上调。YIYA位于1q41，这是一个癌症易感基因位点。YIYA基因也被扩增，其表达与细胞周期调节和细胞增殖有关。

人类癌症的标志之一是葡萄糖代谢的改变。升高的糖酵解（也称为Warburg效应）促进癌细胞生长，血管生成和转移。葡萄糖代谢的关键步骤之一是葡萄糖6-磷酸（G6P）转化为果糖-1,6-二磷酸（F-1,6-BP）或果糖-2,6-二磷酸（F-2,6-BP），其分别由6-磷酸果糖-1-激酶（PFK1）或6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶（PFKFB3）介导。PFK1的酶活性由F-2,6-BP变构激活。PFKFB3的抑制降低了PFK1和葡萄糖通量的酶活性，导致癌细胞生长减少。

使用RNAscope技术确定YIYA在乳腺癌组织中与配对的相邻正常组织中的表达状态，发现超过50％的乳腺癌患者表达YIYA且不到5％的邻近正常组织表现出可检测的YIYA表达（fig1）。具有高YIYA表达的乳腺癌患者表现出较差的无复发存活率。与正常乳腺上皮细胞相比，YIYA在乳腺癌细胞中上调。YIYA的表达调节细胞增殖速率，但对细胞周期的影响小，表明YIYA可能在促进乳腺癌细胞生长中发挥额外作用，这与细胞周期调节无关。

我们使用CRISPR/Cas9技术产生来自MDA-MB-231细胞的敲除（KO）细胞系，YIYA敲低显著减少了三维肿瘤球体的生长和侵袭。将亲本或YIYA 敲低细胞原位注射到小鼠的乳腺脂肪中表明当YIYA耗尽时乳腺肿瘤的生长被显著抑制。因此，我们的数据证明了YIYA在乳腺癌细胞中的潜在致癌作用。

为了解YIYA促进乳腺癌进展的分子机制，我们使用LC-MS鉴定了YIYA的结合蛋白。与空白对照和反义YIYA相比，正义YIYA 与SKP1、 FBXW7和CDK6具有高度相关性。我们证实了CDK6/cyclin-D3，CDK6/SKP1和CDK6/FBXW7之间的相互作用。免疫共沉淀还表明FBXW7分别与CDK6和SKP1相关。然后我们证明YIYA，CDK6和cyclin-D3定位于细胞核和胞质，但主要定位于胞质。

我们使用RIP测定证实了YIYA和YIYA结合蛋白在细胞中的关联。重组全长CDK6直接与YIYA相关，但不与反义转录本相关。此外，CDK6的N-末端，C-末端和K43M均未显示与YIYA的相互作用。FBXW7蛋白含有WD40结构域，已被证明是非典型的RNA结合结构域。FBXW7在体外以依赖于WD40结构域的方式与YIYA相关。

免疫组织化学染色表明，与癌旁相比，CDK6蛋白在乳腺癌组织中升高。此外，在YIYA高表达的乳腺癌组织中，42例病例中超过36例CDK6表达量高; 并且63个YIYA低表达的乳腺癌组织中超过35个CDK6表达量低，表明CDK6和YIYA在乳腺癌组织中的表达之间的相关性。

为了理解YIYA相关的CDK6/cyclin-D3和SKP1/FBXW7复合物如何调节细胞生长，我们使用FLAG标记下拉然后LC-MS鉴定了与CDK6和FBXW7相关的蛋白质。数据表明蛋白质精氨酸甲基转移酶5（ANM5，也称为PRMT5），甲基体蛋白50（MEP50，也称为WDR77），丝氨酸/苏氨酸激酶38（STK38）和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶3（F263，PFK2或PFKFB3）通常与CDK6和FBXW7相关。

接下来，我们分别确认了CDK6，FBXW7与PRMT5，WDR77，PFKFB3和STK38之间的相互作用。我们还检测到内源性CDK6-STK38和CDK6-PFKFB3的相互作用。FBXW7是SCF复合物的底物识别组分，其介导靶蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体降解。FBXW7野生型（WT）的过表达降低了c-Myc蛋白水平，其被F-box结构域缺失突变体（F突变体）阻断，但不被PFKFB3或STK38阻断。

我们假设CDK6-STK38和CDK6-PFKFB3相互作用可能导致STK38和PFKFB3的磷酸化。使用定量体外激酶测定，重组CDK6/CyclinD3复合物以剂量依赖性方式催化ATP合并重组PFKFB3和STK38。

据报道，LncRNA与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结合并可能调节其酶活性。YIYA正转录物但不是反转录物的存在增强了PFKFB3和STK38的CDK6依赖性磷酸化。使用定量体外激酶测定，YIYA正转录物的存在显著增强了CDK6介导的PFKFB3和STK38的磷酸化。因此，我们的数据表明升高的YIYA表达水平可能促进CDK6激酶活性并激活乳腺癌细胞中的下游信号传导通路。 CDK6的酶活性需要细胞周期蛋白的存在。YIYA的存在可能促进CDK6和cyclin D3之间的关联，导致PFKFB3和STK38的磷酸化增强。

PFKFB3催化F-2,6BP；后者变构调节PFK1的酶活性，导致糖酵解增强。据报道，PFKFB3的酶活性在残基S461处被磷酸化，其调节糖酵解。为了证实PFKFB3的CDK6依赖性磷酸化，我们产生了稳定的细胞系，其中CDK6被shRNAs敲低。在CDK6敲低后，Myc标记的PFKFB3的磷酸化降低。Myc标记的PFKFB3野生型，T463A，S467A或T463A/S467A突变体在MDA-MB-231细胞中的表达表明，当T463和S467都突变时，外源性PFKFB3的磷酸化状态受损。野生型PFKFB3而非T463A/S467A突变体的表达增强了FBP/GBP的产生并减少了G6P/F6P的细胞库。这些数据表明CDK6可通过PFKFB3磷酸化调节葡萄糖代谢。

PFKFB3的YIYA/CDK6依赖性磷酸化可能在调节葡萄糖代谢中起关键作用。因此，我们使用基于13C的策略确定代谢通量。对亲本和YYYA KO细胞进行葡萄糖饥饿，然后测量[U-13C]葡萄糖。与亲代细胞相比，YIYA KO细胞中的细胞13C-葡萄糖摄取受损。有趣的是，在YIYA KO细胞中，我们观察到G6P/F6P的积累和FBP/GBP的消耗，表明抑制了从F6P到FBP的转化。一致地，YIYA的消耗导致甘油3磷酸和丙酮酸的产生受损。当YIYA遗传缺失时，乳酸的产生显著减少。在YIYA低表达MCF7细胞中高表达YIYA显著增强葡萄糖消耗和乳酸产生。在YIYA高表达BT474细胞中，YIYA敲低抑制葡萄糖消耗和乳酸产生。此外，CDK6的敲低导致葡萄糖摄取减少和GBP/FBP的产生（图7J和K）。总之，我们的数据表明lncRNA在调节癌症代谢重编程和肿瘤生长中可能在功能上是重要的，使得这些分子成为有吸引力的治疗靶标。

CDK6在癌症糖酵解重编程中的分子机制一直难以捉摸。基于我们收集的数据，在YIYA存在下，CDK6依赖性细胞质磷酸化事件对于促进癌症代谢重编程是重要的。乳腺癌中糖酵解率显著升高，将糖酵解作为确定新的诊断策略和治疗靶点的重要组成部分。我们的数据表明CDK6抑制剂可能阻断乳腺癌糖酵解。

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