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Expression of long non-coding RNA YIYA promotes glycolysis in breast cancer

文字:[大][中][小] 2018/10/25     浏览次数:    

Expression of long non-coding RNA YIYA promotes glycolysis in breast cancer

长非编码RNA YIYA的表达促进乳腺癌中的糖酵解


    期刊:Cancer Research;影响因子:9.130


导 读

前一篇微文我们介绍了lncRNA在精神分裂症患者脑杏仁核区域的表达谱“精神分裂症患者脑杏仁核组织中lncRNA表达谱”。lncRNA在癌中发挥作用报道的很多,然而其调控细胞代谢如糖酵解过程的报道较少,本研究发现lncRNA YIYA可以与CDK6蛋白直接结合,介导PFKFB3的磷酸化,促进糖酵解中葡萄糖代谢,进而促进细胞增殖和肿瘤生长。


摘 要

长链非编码RNAlncRNA)尚未在癌代谢领域研究过。在这里,我们报告lncRNA LINC00538YIYA)的上调促进乳腺癌中的糖酵解,细胞增殖和肿瘤生长。YIYA与细胞质细胞周期蛋白激酶CDK6相关,并以细胞周期非依赖的方式调节果糖二磷酸酶PFK2PFKFB3)的CDK6依赖性磷酸化。在乳腺癌细胞中,这些事件促进葡萄糖6-磷酸催化成果糖-2,6-二磷酸酯/果糖-1,6-二磷酸酯。


研究背景

一种名为YIYA的长非编码RNA被证明在多种癌症类型中被上调。YIYA位于1q41,这是一个癌症易感基因位点。YIYA基因也被扩增,其表达与细胞周期调节和细胞增殖有关。

人类癌症的标志之一是葡萄糖代谢的改变。升高的糖酵解(也称为Warburg效应)促进癌细胞生长,血管生成和转移。葡萄糖代谢的关键步骤之一是葡萄糖6-磷酸(G6P)转化为果糖-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)或果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP),其分别由6-磷酸果糖-1-激酶(PFK1)或6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶(PFKFB3)介导。PFK1的酶活性由F-2,6-BP变构激活。PFKFB3的抑制降低了PFK1和葡萄糖通量的酶活性,导致癌细胞生长减少。


研究结果

1

YIYA是细胞增殖和肿瘤生长所必需的

使用RNAscope技术确定YIYA在乳腺癌组织中与配对的相邻正常组织中的表达状态,发现超过50%的乳腺癌患者表达YIYA且不到5%的邻近正常组织表现出可检测的YIYA表达(fig1)。具有YIYA表达的乳腺癌患者表现出较差的无复发存活率。与正常乳腺上皮细胞相比,YIYA在乳腺癌细胞中上调YIYA的表达调节细胞增殖速率,但对细胞周期的影响小,表明YIYA可能在促进乳腺癌细胞生长中发挥额外作用,这与细胞周期调节无关。

我们使用CRISPR/Cas9技术产生来自MDA-MB-231细胞的敲除(KO)细胞系,YIYA敲低显著减少了三维肿瘤球体的生长和侵袭。将亲本或YIYA 敲低细胞原位注射到小鼠的乳腺脂肪中表明当YIYA耗尽时乳腺肿瘤的生长被显著抑制。因此,我们的数据证明了YIYA在乳腺癌细胞中的潜在致癌作用。

2

YIYACDK6SCF复合体有关

为了解YIYA促进乳腺癌进展的分子机制,我们使用LC-MS鉴定了YIYA的结合蛋白。与空白对照和反义YIYA相比,正义YIYA SKP1、 FBXW7CDK6具有高度相关性。我们证实了CDK6/cyclin-D3CDK6/SKP1CDK6/FBXW7之间的相互作用。免疫共沉淀还表明FBXW7分别与CDK6SKP1相关。然后我们证明YIYACDK6cyclin-D3定位于细胞核和胞质,但主要定位于胞质。


3

YIYA直接与CDK6FBXW7作用

我们使用RIP测定证实了YIYAYIYA结合蛋白在细胞中的关联。重组全长CDK6直接与YIYA相关,但不与反义转录本相关。此外,CDK6N-末端,C-末端和K43M均未显示与YIYA的相互作用。FBXW7蛋白含有WD40结构域,已被证明是非典型的RNA结合结构域。FBXW7在体外以依赖于WD40结构域的方式与YIYA相关。

免疫组织化学染色表明,与癌旁相比,CDK6蛋白在乳腺癌组织中升高。此外,在YIYA高表达的乳腺癌组织中,42例病例中超过36CDK6表达量高并且63YIYA低表达的乳腺癌组织中超过35CDK6表达量低,表明CDK6YIYA在乳腺癌组织中的表达之间的相关性。


4

CDK6FBXW7共同调节PFKFB3STK38

为了理解YIYA相关的CDK6/cyclin-D3SKP1/FBXW7复合物如何调节细胞生长,我们使用FLAG标记下拉然后LC-MS鉴定了与CDK6FBXW7相关的蛋白质。数据表明蛋白质精氨酸甲基转移酶5ANM5,也称为PRMT5),甲基体蛋白50MEP50,也称为WDR77),丝氨酸/苏氨酸激酶38STK38)和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-26-双磷酸酶3F263PFK2PFKFB3)通常与CDK6FBXW7相关。

接下来,我们分别确认了CDK6FBXW7PRMT5WDR77PFKFB3STK38之间的相互作用。我们还检测到内源性CDK6-STK38CDK6-PFKFB3的相互作用。FBXW7SCF复合物的底物识别组分,其介导靶蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体降解。FBXW7野生型(WT)的过表达降低了c-Myc蛋白水平,其被F-box结构域缺失突变体(F突变体)阻断,但不被PFKFB3STK38阻断。


5

YYYA调节CDK6依赖性磷酸化

我们假设CDK6-STK38CDK6-PFKFB3相互作用可能导致STK38PFKFB3的磷酸化。使用定量体外激酶测定,重组CDK6/CyclinD3复合物以剂量依赖性方式催化ATP合并重组PFKFB3STK38

据报道,LncRNA与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结合并可能调节其酶活性。YIYA正转录物但不是反转录物的存在增强了PFKFB3STK38CDK6依赖性磷酸化。使用定量体外激酶测定,YIYA正转录物的存在显著增强了CDK6介导的PFKFB3STK38的磷酸化。因此,我们的数据表明升高的YIYA表达水平可能促进CDK6激酶活性并激活乳腺癌细胞中的下游信号传导通路。 CDK6的酶活性需要细胞周期蛋白的存在。YIYA的存在可能促进CDK6cyclin D3之间的关联,导致PFKFB3STK38的磷酸化增强。


6

PFKFB3的磷酸化促进糖酵解

PFKFB3催化F-2,6BP后者变构调节PFK1的酶活性,导致糖酵解增强。据报道,PFKFB3的酶活性在残基S461处被磷酸化,其调节糖酵解。为了证实PFKFB3CDK6依赖性磷酸化,我们产生了稳定的细胞系,其中CDK6shRNAs敲低。在CDK6敲低后,Myc标记的PFKFB3的磷酸化降低。Myc标记的PFKFB3野生型,T463AS467AT463A/S467A突变体在MDA-MB-231细胞中的表达表明,当T463S467都突变时,外源性PFKFB3的磷酸化状态受损。野生型PFKFB3而非T463A/S467A突变体的表达增强了FBP/GBP的产生并减少了G6P/F6P的细胞库。这些数据表明CDK6可通过PFKFB3磷酸化调节葡萄糖代谢。


7

YIYACDK6共同调节葡萄糖代谢

PFKFB3YIYA/CDK6依赖性磷酸化可能在调节葡萄糖代谢中起关键作用。因此,我们使用基于13C的策略确定代谢通量。对亲本和YYYA KO细胞进行葡萄糖饥饿,然后测量[U-13C]葡萄糖。与亲代细胞相比,YIYA KO细胞中的细胞13C-葡萄糖摄取受损。有趣的是,在YIYA KO细胞中,我们观察到G6P/F6P的积累和FBP/GBP的消耗,表明抑制了从F6PFBP的转化。一致地,YIYA的消耗导致甘油3磷酸和丙酮酸的产生受损。当YIYA遗传缺失时,乳酸的产生显著减少。在YIYA低表达MCF7细胞中高表达YIYA显著增强葡萄糖消耗和乳酸产生。在YIYA高表达BT474细胞中,YIYA敲低抑制葡萄糖消耗和乳酸产生。此外,CDK6的敲低导致葡萄糖摄取减少和GBP/FBP的产生(图7JK)。总之,我们的数据表明lncRNA在调节癌症代谢重编程和肿瘤生长中可能在功能上是重要的,使得这些分子成为有吸引力的治疗靶标。


讨 论

CDK6在癌症糖酵解重编程中的分子机制一直难以捉摸。基于我们收集的数据,在YIYA存在下,CDK6依赖性细胞质磷酸化事件对于促进癌症代谢重编程是重要的。乳腺癌中糖酵解率显著升高,将糖酵解作为确定新的诊断策略和治疗靶点的重要组成部分。我们的数据表明CDK6抑制剂可能阻断乳腺癌糖酵解。



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