The Long Noncoding RNA Landscape in Amygdala Tissues from Schizophrenia Patients

The Long Noncoding RNA Landscape in Amygdala Tissues from Schizophrenia Patients

精神分裂症患者脑杏仁核组织中长链非编码RNA表达谱

       期刊：EBioMedicine；影响因子:6.183

       发表单位：宾夕法尼亚大学

       精神疾病非编码RNA表达谱研究，本研究使用不同精神状态脑杏仁核区域与正常人杏仁核区域进行RNAseq，鉴定lncRNA, mRNA的表达情况。分析精神分裂症患者脑杏仁核区域与正常人基因差异表达情况。通过相关性分析，WGCNA分析等将lncRNA关联到mRNA，以鉴定lncRNA的功能。

       大多数精神分裂症的转录组研究都集中在蛋白质编码基因的上。长链非编码RNA正在成为细胞和疾病过程的关键组织特异性调节因子。杏仁核脑区与精神分裂症的病理生理学有关。我们使用RNA-seq对来自22名精神分裂症患者和24名非精神病学对照的杏仁核组织进行了转录组学研究。我们重建了杏仁核转录组，并采用系统生物学方法来诠释lncRNA的功能作用。因此，我们鉴定了839种新lncRNA。lncRNAs比蛋白质编码基因更具亚型特异性。我们确定了与“突触传递”，“核糖体”和“免疫反应”相关的功能模块，这些模块与涉及lncRNA的精神分裂症病理生理学相关。

       研究lncRNAs的主要障碍是它们的低表达水平。它需要非常高的RNA-Seq测序深度，这在许多先前的转录组研究中通常是缺乏的。因此，尽管已经进行了许多精神分裂症的转录组研究，但大多数研究都没有研究lncRNAs，部分原因是由于测序深度要求高以及目前已知的lncRNA缺乏注释。刘等人表明精神分裂症患者杏仁核区非编码RNA失调，但对于lncRNA在精神分裂症中的功能作用缺乏系统的论证。通过其在情绪处理中的重要作用，杏仁核地区已经参与了精神分裂症的病理生理学。为了鉴定与精神分裂症相关的杏仁核特异性lncRNAs，我们使用具有高测序深度的RNA-seq进行了人类杏仁核区域的无偏全转录组特异性分析。

       样本：我们从Lieber脑库（http://www.libd.org）获得了死后大脑的45个杏仁核样本，包括9个未分化，7个紊乱，5个偏执狂和24个没有精神病诊断的对照。样本描述和RNA-Seq数据可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/379666获得。

       建库方法：富集PolyA尾方法建库。

       分析方法：HISAT2比对，StringTie组装，DESeq2差异分析，WGCNA共表达网络构建，GSEA功能富集分析。

       为了发现新的lncRNA，我们首先从所有45个样品的RNA-Seq数据组装转录组，去除具有蛋白质编码潜力或低质量数据的转录本。我们鉴定了一组高质量的839个的lncRNA基因。我们发现这些新型lncRNA中的绝大多数（> 80％）是基因间的，完全落入基因间区域。大约10％是反向的，以与编码基因相反的方向转录，它们与它们共享启动子。我们发现很少有lncRNA是miRNA宿主基因或snoRNA宿主基因。为了进一步评估这些新型lncRNA的可靠性，我们应用相同的方法从79 GTEx正常杏仁核组织的RNA-Seq数据集组装转录组。结果，我们鉴定到215个新的lncRNAs，即在GTEx转录组中发现的所有外显子，并且106个新的lncRNA在GTEx数据集中部分恢复。

       我们首先比较了我们组装的转录组的结构，表达水平和编码潜能。发现，与蛋白质编码基因相比，新的lncRNAs具有明显更短的转录长度，较短的ORFs和较长的外显子。与mRNA相比，这些性质与lncRNA的外显子估计数较低一致。总之，我们得出结论，杏仁核lncRNAs比mRNA更短，更复杂。

然后我们使用CPAT测量了lncRNA和mRNA的蛋白质编码潜力。我们发现已知的lncRNAs和新的lncRNAs具有相当的低蛋白质编码潜力，显著低于mRNAs。在其他人体组织中观察到类似的发现。

       为了表征精神分裂症相关的基因表达失调，我们对精神分裂症亚型进行了四次差异表达分析，与正常对照样本进行比较：（1）所有SCZs与对照，（2）紊乱SCZs与对照，（3）偏执SCZs与对照，和（4）未分化SCZs与对照，来寻找常见的SCZ相关基因以及SCZ亚型特异性基因。在调整p值<0.05的情况下，这四种比较分别有345, 182, 2和541个差异表达的基因。总结了3种亚型中差异表达的mRNA的比较。其中，我们发现了在先前研究报道的所有SCZ样本中显著差异表达的几种蛋白质编码基因。这些包括HBA1，HBA2，HBB，IFITM1，GBP1，IFITM2，SERPINA3。这些结果与先前关于精神分裂症患者杏仁核中蛋白质编码基因的研究相同。

       为了确定哪些功能通路最强烈地参与精神分裂症发病机制，我们对每个亚型进行了基因集富集分析（GSEA）。在FDR水平为0.1（标准p值<0.005）时，有178个，40个，355个和123个GO术语正富集基因，并且在所有SCZ，紊乱的SCZ，偏执的SCZ和未分化的SCZ有分别有94,147,4和107个GO术语为负富集基因。当考虑所有SCZ与正常对比时，我们发现失调的途径来自四个主要类别：“免疫”、“血管发育”、“核糖体和蛋白质合成”被上调、“神经元和突触”被下调。我们得出结论，在精神分裂症患者的杏仁核组织中，与免疫应答，血管发育和核糖体相关的基因途径在表达上调，与突触传递和行为相关的基因途径被抑制。

       为了确定杏仁核lncRNAs是否是精神分裂症中的亚型特异性，我们将三种精神分裂症亚型中的lncRNA和mRNA的表达特征与对照组进行了比较。基于无监督的表达谱聚类，大量的lncRNA表现出亚型特异性表达模式。此外，我们使用依赖于Jensen-Shannon（JS）的基于熵的度量来计算每个基因的亚型特异性得分。发现lncRNAs的表达比mRNA显着更具亚型特异性n。

       缺乏诠释使得研究lncRNA功能成为一项具有挑战性的任务。然而，“通过关联”分析有助于预测哺乳动物lncRNA的作用。因为具有相似共表达模式的基因倾向于具有相似的功能，我们使用高表达的530个lncRNA和7382个mRNA，通过分析每个lncRNA的表达动力学与45个SCZ和正常样品中每个mRNA的表达动力学的相关性，进行了基因集富集分析来关联GO terms and lncRNA。结果，529个lncRNA被鉴定为具有显著相关的GO术语。我们通过层次聚类将lncRNA分组为10个簇。我们发现几个簇与不同功能类别的蛋白质编码基因组相关，如核糖体和蛋白质合成（簇A），血管发育（簇C），神经系统和突触传递（簇H）和免疫。系统（簇I）（图4b）。发现这些途径在精神分裂症中失调。

       我们使用WGCNA建立了高表达的7912基因（包括530个lncRNA和7382个mRNA）的共表达网络，然后进行了网络模块分析（共使用了45个样本）。我们确定了23个共表达模块（补充表 S6），其中7个与精神分裂症性状高度相关（图5a）：绿松石，绿色，粉红色，绿色黄色，鲑鱼色，深色和深绿色（相关p值<0.05）。为了识别每个模块的功能，我们对mRNA进行了超几何检验，以检测每个模块中富集的GO术语。我们发现绿松石模块富含神经元相关途径，绿色模块富含核糖体途径，以及鲑鱼色模块富含免疫应答相关途径（图S2）。

       在之后，我们将具有最高模块内连通性的5％节点定义为hub基因。连通性反映了节点与共表达模块中的其他节点交互的频率。hub基因具有最高的连接性，通常被认为是基因共表达网络中的关键调节因子，因为它们与更多基因相互作用。绿松石模块由来自神经元途径的基因富集，并且他们中的许多成员被观察为hub基因。我们确实找到lncRNA“ENSG00000225465.8”（RFPL1S）作为绿松石的hub基因，这表明这种lncRNA可能作为该功能模块中的关键调节因子。有趣的是，与“ENSG00000225465.8”正相关的基因通路包括轴突，突触，树突以及其他类似途径。在绿松石模块中有20个lncRNA直接连接到hub基因。我们发现它们中的大多数与突触途径正相关。相反，在绿色和鲑鱼色模块中，没有lncRNA被鉴定为hub基因，但是有几个lncRNA与hub基因直接相关。在绿色模块中，有23个lncRNA直接连接到hub基因。GSEA显示所有这些lncRNA与核糖体途径相关。如GSEA所示，在鲑鱼色模块中，我们直接鉴定了与hub基因连接的一个lncRNA：“ENSG00000235501.5”（RP4-639F20.1），其与免疫途径相关。为了将所有这些结果结合起来，通过基因共表达网络，我们鉴定了七个与SCZ特征相关的共表达模块。我们发现这7个模块中有3个分别以神经元和突触，核糖体和免疫为主。所有这些结果表明lncRNA可能参与精神分裂症相关的功能途径。

       与先前的RNA-Seq研究一致，我们的结果显示lncRNAs比组织中的编码基因低约10倍。lncRNAs的一个众所周知的特征是它们的组织特异性。在这里，我们还观察到精神分裂症的不同亚型中的高特异性lncRNA，即使在单一组织中—即杏仁核。对此的解释是，即使在单个组织中，与mRNA相比，不同患者的lncRNA可能变化更大。据我们所知，这是第一次研究表明，lncRNAs在精神分裂症中的疾病亚型之间的差异显著大于mRNA。

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