Identification and Functional Characterization of Long Non-coding RNA MIR22HG as a Tumor Suppressor for Hepatocellular Carcinoma

Identification and Functional Characterization of Long Non-coding RNA MIR22HG as a Tumor Suppressor for Hepatocellular Carcinoma

肝细胞癌肿瘤抑制因子lncRNA MIR22HG的鉴定和功能研究

    期刊：Theranostics；影响因子：8.537  

    发表单位：南方医科大学

    之前的微文中我们介绍了如何通过lncRNA保守性寻找重要的lncRNA，如“lncRNA通过保守序列发挥作用”，lncRNA通过其衍生的miRNA发挥作用如：“lncRNA MIR100HG衍生的miR-100和miR-125b通过Wnt/β-catenin信号传导介导西妥昔单抗耐药”。本研究发现肝癌中下调lncRNA MIR22HG表达进而抑制其衍生的miRNA miR-22-3p，促进靶基因HMGB1表达进而促进肿瘤细胞增殖，迁移，侵袭和转移。另外，MIR22HG竞争性结合HuR，使得HuR稳定的癌基因表达减弱，进而起到抑癌作用。

    方法：我们评估了52例患者，145例患者，TCGA和GSE14520 HCC数据中的MIR22HG表达。体外和体内分析MIR22HG对HCC的增殖，侵袭和转移的影响。通过生物信息学，荧光素酶报告基因和RNA免疫沉淀分析探索MIR22HG作用的机制。

    结果：与对照组相比，4组HCC实验中MIR22HG表达显著下调。其低表达与HCC患者的肿瘤进展和不良预后有关。体外和体内HCC细胞上调表达MIR22HG显著抑制增殖，侵袭和转移。从机理上讲，MIR22HG衍生miR-22-3p以靶向基因HMGB1，从而抑制HMGB1下游途径。另外，MIR22HG直接与HuR相互作用并调节其亚细胞定位。MIR22HG与人抗原R（HuR）竞争性结合，导致HuR稳定的癌基因如β-连环蛋白的表达减弱。此外，miR-22-3p抑制，HuR或HMGB1过表达挽救了MIR22HG过表达引起的抑制作用。

    结论：我们的研究结果显示，MIR22HG通过抑制肿瘤细胞的增殖，侵袭和转移在肿瘤进展中起关键作用，这表明其在HCC中作为肿瘤抑制因子和预后生物标志物的潜在作用。

    长链非编码RNA参与各种生理过程，其失调与多种人类疾病相关，包括癌症。之前的研究中，我们检查了HCC组织和癌旁lncRNA表达谱发现位于17p13.3中的lncRNA NR_028502.1是一种染色体区域，在肝癌中经常被删除、高度甲基化或显示出杂合性缺失，在HCC中被下调。NR_028502.1在ENCODE数据库中被鉴定为lncRNA，并注释为人miR-22宿主基因（MIR22HG）。然而，尚未研究MIR22HG的生物学功能。

    我们之前的微阵列分析表明，与癌旁相比，MIR22HG在HCC组织中的表达水平较低（P = 0.016）。人MIR22HG由4个转录物组成。我们在7对HCC组织和相应的癌旁中检测到这4种转录物的表达，发现变体1是癌旁中最丰富的同种型，但在肿瘤组织中显著下调。因此，我们专注于变体1以获得对MIR22HG的进一步了解。然后我们通过qRT-PCR检测52对HCC组织和匹配的非肿瘤组织（52名患者实验）中的MIR22HG表达，发现MIR22HG在HCC中显著下调（P <0.001）。此外，来自两个独立HCC实验（癌症基因组图谱（TCGA）和GEO登录号GSE14520）的表达数据用于验证（fig1）。这两个群组中，HCC组织中MIR22HG的表达也降低（两个群组的P <0.001）。这些发现证实MIR22HG在HCC中表达下调。

    为了评估MIR22HG表达的临床意义，我们对145个人HCC组织进行了原位杂交（ISH）。ISH测定显示MR22HG在HCC中以低水平表达并且主要位于细胞质中。低MR22HG表达与不良病理分级（P = 0.004），PVTT（P = 0.004）和晚期临床分期（P = 0.005）密切相关，表明MIR22HG与HCC的临床进展呈负相关。145例患者实验的生存分析显示，与低MIR22HG表达的患者相比，HCC和高MIR22HG表达的患者总生存期（OS; P = 0.001）和无病生存期（DFS; P = 0.042）表现更好。这一发现在TCGA实验中得到验证。此外，单变量Cox回归分析显示，HCC患者的死亡风险与低MIR22HG表达显著相关（95％），临床分期（95％CI：1.077-3.101; P = 0.025），肿瘤复发（95％CI：1.164-3.249; P = 0.011）和肿瘤大小（95％CI：1.123-3.308; P = 0.017）。在多因素变量分析中，较低的MIR22HG表达作为HCC患者OS的独立预后因素出现（95％CI：0.270-0.912; P = 0.024）。

    为了评估MIR22HG在HCC中的生物学功能，将人MIR22HG序列转染到SK-Hep-1和SMMC-7721细胞中以稳定表达。结果显示MIR22HG过表达显著降低细胞增殖能力。此外，使用小鼠皮下异种移植实验发现，MIR22HG过表达SK-Hep-1和SMMC-7721细胞的肿瘤异种移植表现出比来自空载体转染细胞的肿瘤更小的体积和更低的重量。另外，在MIR22HG过表达细胞中，Ki-67（增殖标记物）的阳性率显著降低。这些结果证明MIR22HG在体外和体内抑制HCC细胞增殖。另外，将特异性靶向MIR22HG的短发夹RNA引入HCC-LM3细胞以沉默MIR22HG，结果表明MIR22HG敲低促进体外和体内细胞增殖。在MIR22HG沉默的HCC-LM3细胞中，Ki-67的阳性率显著增加。体外迁移和侵袭测定均显示MIR22HG上调显著降低SK-Hep-1和SMMC-7721细胞的迁移和侵袭（P <0.001），而MIR22HG敲低促进了HCC-LM3细胞的迁移和侵袭。为了在体内证实这些数据，通过尾静脉将MIR22HG过表达的SK-Hep-1细胞和MIR22HG沉默的HCC-LM3细胞静脉内注射到裸鼠中。MIR22HG过表达抑制SK-Hep-1细胞向肺的转移。总之，这些数据表明MIR22HG抑制HCC细胞侵袭和转移。

    哺乳动物中含有miR-22的MIR22HG区域的高度保守性意味着miR-22的重要作用。SMMC-7721和SK-Hep-1细胞中MIR22HG的过表达明显地增加了miR-22-3p的表达水平，而HCC-LM3细胞中MIR22HG下调显著降低miR-22-3p的表达。为了确定该miRNA的临床意义，我们分析了52名患者、TCGA和GSE10694实验中的miR-22-3p表达。结果显示，与非肿瘤组织相比，miR-22-3p在HCC组织中显著下调。此外，miR-22-3p表达与HCC患者的OS和DFS显著相关。

我们随后评估了MIR22HG和miR-22-3p异常表达是否与HCC相关。在52名患者（r = 0.589; P <0.001）和TCGA（r = 0.585; P <0.001）实验中发现显著的正相关。

TCGA数据GSEA分析证明MIR22HG和miR-22-3p的表达与转移的基因呈负相关。另外，体外迁移和侵袭测定表明miR-22-3p过表达损害了细胞迁移率和侵袭性，但是miR-22-3p敲低促进了细胞迁移和侵袭。过表达MIR22HG的SK-Hep-1和SMMC-7721细胞中抑制miR-22-3p表达显示敲低miR-22-3p挽救了MIR22HG过表达降低的迁移和侵袭能力。

    为了研究由MIR22HG调节的miR-22-3p的靶标，我们使用miRanda和picTar算法进行生物信息学分析，并发现了一组miR-22-3p的潜在靶基因。将这些基因与肝癌中上调的基因重叠（GSE14520和GSE6762数据集），产生5个候选基因，包括HMGB1，CD147，TIAM1，MYCBP。然而，在miR-22-3p或MIR22HG过表达后，只有HMGB1蛋白在SMMC-7721细胞中下调。相关性分析显示HMGB1蛋白的相对表达与20个HCC样品中的miR-22-3p表达负相关（r = -0.454; P = 0.045）。这些发现表明HMGB1可能代表HCC中miR-22-3p的靶标。

为了验证miR-22-3p和HMGB1之间的直接相互作用，将HMGB1的3'非翻译区（UTR）克隆到荧光素酶报告载体中，将其与miR-22-3p模拟物一起转染到SMMC-7721细胞中。为了排除非特异性结合，我们突变HMGB1的3UTR的miR-22-3p结合位点以产生。荧光素酶报告基因测定显示miR-22-3p模拟物转染显著降低了野生型HMGB1的荧光素酶活性，但对psiCHECK-mut-HMGB1的活性没有影响。然后我们评估HMGB1是否受MIR22HG调节。荧光素酶测定显示MIR22HG过表达显著降低了psiCHECK-wt-HMGB1的荧光素酶活性；然而，通过应用miR-22-3p抑制剂挽救了这种效应，表明MIR22HG产生miR-22-3p以结合HMGB1的3'UTR。

    为了鉴定MIR22HG的功能是否完全依赖于miR-22-3p，我们突变MIR22HG的miR-22-3p区域以产生MIR22HG-mut载体并建立过表达突变型MIR22HG的稳定HCC细胞。miR-22-3p的表达在野生型MIR22HG过表达后增加，但在突变型MIR22HG过表达后没有增加。另外，突变体MIR22HG显著损害SMMC-7721细胞的增殖，迁移和侵袭能力（P <0.01）。然而，突变型MIR22HG的抑制作用弱于野生型MIR22HG（P <0.01），这表明MIR22HG部分通过miR-22-3p起抑制作用。ISH和细胞质和核RNA组分测定的结果证明MIR22HG主要位于HCC细胞和组织的细胞质中。使用HuR光活化核糖核苷酸增强的交联，免疫复制（PAR-CLIP; GSE28865）分析和StarBase软件v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/rbp LncRNA.php）的生物信息学分析预测MIR22HG可能与HuR蛋白相互作用（图6A）。因此，RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）测定证实了MIR22HG和HuR之间的直接结合关系。此外，通过缩短SMMC-7721细胞中MIR22HG的半衰期，HuR敲低显著降低MIR22HG表达。该现象表明HuR结合并稳定了MIR22HG RNA。为了进一步了解HuR和MIR22HG之间的关系，我们首先在HCC组织中检测到HuR mRNA和MIR22HG的表达。在HuR mRNA和MIR22HG表达之间未发现显著相关性（P = 0.334; r = 0.033）。HuR可以直接结合和控制mRNA，miRNA和lncRNA的功能。HuR靶标包括许多致癌mRNA，例如CTNNB1，CCNB1，HIF1A，BCL2，COX2，MDM2，VEFGA和C-FOS。RIP测定证实HuR直接与这些mRNA结合。RIP分析表明，在MIR22HG存在下，MIR22HG和HuR之间的结合显著增加，从而降低了HuR与癌基因（包括CTNNB1，CCNB1，HIF1A，BCL2，COX2和C-FOS）的结合能力，但不是MDM2和VEGFA。总的来说，我们的数据表明HuR可能在MIR22HG介导的肿瘤抑制中起关键作用。

    据我们所知，这是第一次研究MIR22HG在癌症中的生物学功能的研究。强有力的证据表明，与基于4个实验的非肿瘤肝组织相比，MIR22HG在HCC组织中以低水平表达。我们的结果显示低MIR22HG表达与肿瘤进展相关，并且MIR22HG表达代表HCC患者预后的独立预测因子。功能上，MIR22HG过表达抑制肿瘤细胞增殖，迁移，侵袭和转移。因此，我们的数据表明MIR22HG表达是控制人类HCC进展的重要因素。MIR22HG通过衍生miR-22-3p和竞争性结合HuR来抑制HCC细胞增殖，侵袭和转移，导致多种癌基因的下调和HMGB1信号传导的失活。我们还发现MIR22HG可以调节HuR亚细胞定位。我们的研究结果支持lncRNA在HCC中的关键作用可能会确定治疗HCC的新治疗靶点。

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