The human lncRNA LINC-PINT inhibits tumor cell invasion through a highly conserved sequence element

人lncRNA LINC-PINT通过高度保守的序列元件抑制肿瘤细胞侵袭

期刊：Genome Biology；影响因子：13.214  

发表单位：纳瓦拉大学

LncRNA保守性比较低，但部分序列仍是多物种保守的。这种保守序列与其功能密切相关，从保守序列入手或许是寻找重要功能lncRNA的一个好办法。此前介绍过三篇挑选超保守区域lncRNA，进行功能研究的文章“RNAseq得到差异lncRNA那么多，该如何找到需要的lncRNA?”，超保守lncRNA在癌/睾丸中结合IGF2BP1形成复合物调控靶标基因（cell, IF:31.398）；“根据保守性挑选重要功能lncRNA”，lncRNA抑制miRNA生成促进靶基因表达（Gastroenterology, IF:20.773）；“超保守lncRNA驱动肝脏脂肪积累”，lncRNA抑制miRNA成熟（nature communications, IF:12）。本研究发现LINC-PINT在多物种中保守，并在多种癌组织/癌细胞中下调，可抑制癌细胞侵袭。其发挥作用是通过高保守区序列实现的。

LncRNA保守性比较低，但部分序列仍是多物种保守的。这种保守序列与其功能密切相关，许多lncRNAs可以调节基因功能和基因表达。主要挑战之一是鉴定lncRNA功能序列元件。lncRNAs的一个独特特征是它们物种保守性相对较低。许多人类lncRNAs不存在于其他生物体中，而其他生物体虽然在其他物种中发现，但其序列保守程度有限。这些序列可能包含其功能所需的元件。本研究鉴定到 LINC-PINT在癌症中充当抑癌因子，其保守序列发挥主要作用。

之前研究，我们鉴定小鼠Linc-pint是由p53诱导的lncRNA，其调节细胞增殖。人同源转录本LINC-PINT也受p53的转录调控，在TP53突变的肿瘤中，LINC-PINT的表达降低。我们还观察到，结直肠癌患者肿瘤组织中LINC-PINT的表达降低。结直肠癌细胞系中LINC-PINT的表达降低。TCGA分析显示LINC-PINT在几种癌症类型中显著降低，包括乳腺，子宫内膜和肺鳞状细胞癌等。而较低水平的RNA与患者的存活率降低显著相关，表明LINC-PINT表达与肿瘤侵袭性之间呈负相关（fig1）。

首先，我们在结直肠癌（HCT116）和肺腺癌细胞系（A549）高表达LINC-PINT。RNA-FISH显示LINC-PINT定位于细胞核中，与内源lncRNA相似。免疫缺陷小鼠过表达LINC-PINT，形成肿瘤的能力下降，表明LINC-PINT抑制肿瘤细胞的侵袭性。

我们进一步研究了几种癌细胞系中LINC-PINT的高表达的表型。LINC-PINT抑制细胞增殖，细胞迁移和侵袭能力的显著下降。敲低LINC-PINT导致细胞的侵袭能力增加。

使用小鼠肝转移模型测试LINC-PINT是否也能够抑制体内细胞侵袭。 虽然对照和LINC-PINT细胞都能够转移到肝脏，但在LINC-PINT过表达细胞中，大转移和微转移的数量显著减少。结果表明LINC-PINT不仅抑制细胞在体外侵入的能力，而且还降低了体内细胞的植入潜力。

LINC-PINT在整个哺乳动物、鸟类中具有序列相似的同源转录本。此外，我们发现p53对LINC-PINT的转录调控在小鼠和人之间是保守的。小鼠Lincpint在人类细胞中的高表达与人类lncRNA具有相似的作用。我们推断LINC-PINT的活性依赖于保守的RNA序列。实际上，鼠和人转录本之间的序列比较分析显示在人LINC-PINT的核苷酸535和924之间的区域中具有高度同源性（e值2.00E-74）。为了测试lncRNA的这个区域的功能，我们产生了截短形式的LINC-PINT。与全长LINC-PINT相比，低保守区对HCT116细胞的入侵能力或增殖没有影响。高保守区可以将侵入性降低到甚至低于全长LINC-PINT的水平，表明LINC-PINT的这个保守区足以发挥作用。

我们将LINC-PINT跨物种分析扩展到17种哺乳动物。比较分析鉴定了LINC-PINT功能性HCR内的几个短保守元件。我们对这些序列进行了不同的缺失，产生了缺少CE1的ΔCE1突变体，实验表明缺乏CE1完全消除了LINC-PINT的作用和肿瘤形成。

   LINC-PINT的功能获得对癌细胞的侵袭能力具有强烈影响。为了确定所涉及的细胞途径，我们过表达并通过微阵列进行基因表达分析。其中233上调和301下调。差异基因富集到不同的生物学功能，最重要的是细胞发育，细胞运动和细胞生长和增殖。详细分析肿瘤细胞粘附网络时，我们发现与癌细胞迁移能力相关几个基因下调，如早期生长反应1（EGR1），磷脂酶D1（PLD1），白血病抑制因子（LIF） ，FBJ骨肉瘤癌基因（FOS），SERPINE1，纤连蛋白1（FN1）或整合素α3（ITGA3）。这些基因表达变化与细胞增殖和侵袭能力的降低一致，通过qRT-PCR独立验证。

我们研究LINC-PINT如何导致侵袭基因下调。有趣的是，当小鼠Lincpint在人体细胞中表达时，这种特征的几个基因也被下调，表明它们的抑制是由小鼠和人类形式共有的机制引起的。之前已经证明，LINC-PINT的小鼠转录本与PRC2相互作用，并且它是通过这种蛋白质复合物有效靶向和抑制基因所必需的。然后我们通过检测PRC2免疫沉淀物中LINC-PINT的特异性富集，证实LINC-PINT和PRC2在不同起源的人细胞中相互作用，包括正常细胞系和癌细胞系。我们假设LINC-PINT的活动可能至少部分与PRC2有关。然后，我们研究了由LINC-PINT诱导的这些基因所观察到的表达变化是否由PRC2介导。为了测试这一点，我们通过使用针对复合物的催化亚基EZH2的shRNA抑制LINC-PINT过表达HCT116细胞中PRC2的表达，并通过qRT-PCR分析了几种基因的表达，大多数基因的表达水平由PRC2敲低诱导，表明它们通过LINC-PINT的沉默是PRC2依赖性的。 ChIP-qPCR显示当LINC-PINT高表达时SUZ12与所有启动子的结合显著增加。伴随着PRC2占据的增加，几乎所有分析的基因启动子（6/8）都显示出PRC2催化的表观遗传修饰H3K27me3的水平显著增加。总之，结果表明LINC-PINT与PRC2共同作用以提高参与细胞侵袭基因的表达。

接下来，为了研究与PRC2的相互作用涉及LINC-PINT的哪个区域，我们在与甲醛（fRIP）交联并结合RNA组分后应用RIP。我们观察到CE1区域引物定位的最高浓度，表明LINC-PINT的这一部分介导其与PRC2的相互作用。最后，我们进一步测试了LINC-PINT在体外结合PRC2的能力是否依赖于CE1序列。为此，我们合成了LINC-PINT的不同突变形式，以及FL LINC-PINT和反义全长作为对照。结果证实，尽管高保守区是测试的RNA突变体中最短的，但全长LINC-PINT和高保守区突变体以最高亲和力结合PRC2。

我们的数据显示LINC-PINT（HCR）的截短序列包含抑制癌细胞迁移所必需的所有元素。此外，我们发现了一个短序列motif（CE1），它在哺乳动物中高度保守并且是LINC-PINT功能所必需的。

我们的研究结果证明了LINC-PINT在癌症进展和肿瘤恶性肿瘤中下调。此外，它们支持LINC-PINT和PRC2之间保守的功能性共依赖性，其抵消EGR1对基因的激活。它引导我们提出一种新的机制，lncRNA调节特定基因组区域附近的PRC2的可用性，表明lncRNA和DNA结合蛋白之间的相互作用可能与调节蛋白质-蛋白质相互作用相关。

其他相关文献解读

文献解读：nature communications：超保守lncRNA驱动肝脏脂肪积累（IF:12）

文献解读：根据保守性挑选重要功能lncRNA（Gastroenterology，IF:20.773）

文献解读：Science：lncRNA调节细胞代谢促进病毒增殖

文献解读：Nature medicine：EGFR同义突变引起靶向药耐药是由lncRNA EGFR-AS1介导的 （IF：32.621）

文献解读：肿瘤耐药中lncRNA, miRNA是怎么发挥作用的呢

文献解读：RNAseq得到差异lncRNA那么多，该如何找到需要的lncRNA?

文献解读：肝癌干细胞基因间lncTCF7 cis 调控临近基因表达