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The human lncRNA LINC-PINT inhibits tumor cell invasion through a highly conserved sequence element

文字:[大][中][小] 2018/10/26     浏览次数:    

The human lncRNA LINC-PINT inhibits tumor cell invasion through a highly conserved sequence element

人lncRNA LINC-PINT通过高度保守的序列元件抑制肿瘤细胞侵袭


期刊Genome Biology影响因子13.214  

发表单位:纳瓦拉大学



导 读

LncRNA保守性比较低,但部分序列仍是多物种保守的。这种保守序列与其功能密切相关,从保守序列入手或许是寻找重要功能lncRNA的一个好办法。此前介绍过三篇挑选超保守区域lncRNA,进行功能研究的文章“RNAseq得到差异lncRNA那么多,该如何找到需要的lncRNA?”,超保守lncRNA在癌/睾丸中结合IGF2BP1形成复合物调控靶标基因(cell, IF:31.398);“根据保守性挑选重要功能lncRNA”,lncRNA抑制miRNA生成促进靶基因表达(Gastroenterology, IF:20.773);“超保守lncRNA驱动肝脏脂肪积累lncRNA抑制miRNA成熟(nature communications, IF:12)。本研究发现LINC-PINT在多物种中保守,并在多种癌组织/癌细胞中下调,可抑制癌细胞侵袭。其发挥作用是通过高保守区序列实现的。


研究背景

LncRNA保守性比较低,但部分序列仍是多物种保守的。这种保守序列与其功能密切相关,许多lncRNAs可以调节基因功能和基因表达。主要挑战之一是鉴定lncRNA功能序列元件。lncRNAs的一个独特特征是它们物种保守性相对较低。许多人类lncRNAs不存在于其他生物体中,而其他生物体虽然在其他物种中发现,但其序列保守程度有限。这些序列可能包含其功能所需的元件。本研究鉴定到 LINC-PINT在癌症中充当抑癌因子,其保守序列发挥主要作用

结 果

1

LINC-PINT的发现

之前研究,我们鉴定小鼠Linc-pint是由p53诱导的lncRNA,其调节细胞增殖。人同源转录本LINC-PINT也受p53的转录调控,在TP53突变的肿瘤中,LINC-PINT的表达降低。我们还观察到,结直肠癌患者肿瘤组织中LINC-PINT的表达降低。结直肠癌细胞系中LINC-PINT的表达降低。TCGA分析显示LINC-PINT在几种癌症类型中显著降低,包括乳腺,子宫内膜和肺鳞状细胞癌等。而较低水平的RNA与患者的存活率降低显著相关,表明LINC-PINT表达与肿瘤侵袭性之间呈负相关(fig1)。


2

LINC-PINT在体外和体内抑制癌细胞的迁移和侵袭

首先,我们在结直肠癌HCT116)和肺腺癌细胞系(A549表达LINC-PINTRNA-FISH显示LINC-PINT定位于细胞核中,与内源lncRNA相似。免疫缺陷小鼠过表达LINC-PINT,形成肿瘤的能力下降,表明LINC-PINT抑制肿瘤细胞的侵袭性。

我们进一步研究了几种癌细胞系中LINC-PINT表达的表型。LINC-PINT抑制细胞增殖,细胞迁移和侵袭能力的显著下降。敲低LINC-PINT导致细胞的侵袭能力增加。

使用小鼠肝转移模型测试LINC-PINT是否也能够抑制体内细胞侵袭。 虽然对照和LINC-PINT细胞都能够转移到肝脏,但在LINC-PINT过表达细胞中,大转移和微转移的数量显著减少。结果表明LINC-PINT不仅抑制细胞在体外侵入的能力,而且还降低了体内细胞的植入潜力。


3

LINC-PINT的保守RNA序列元件是抑制细胞侵袭所必需的

LINC-PINT在整个哺乳动物、鸟类中具有序列相似的同源转录本。此外,我们发现p53LINC-PINT的转录调控在小鼠和人之间是保守的。小鼠Lincpint在人类细胞中的表达与人类lncRNA具有相似的作用。我们推断LINC-PINT的活性依赖于保守的RNA序列。实际上,鼠和人转录之间的序列比较分析显示在人LINC-PINT的核苷酸535924之间的区域中具有高度同源性e2.00E-74)。为了测试lncRNA的这个区域的功能,我们产生了截短形式的LINC-PINT。与全长LINC-PINT相比,低保守区HCT116细胞的入侵能力或增殖没有影响。高保守区可以将侵入性降低到甚至低于全长LINC-PINT的水平,表明LINC-PINT的这个保守区足以发挥作用。

我们将LINC-PINT跨物种分析扩展到17种哺乳动物。比较分析鉴定了LINC-PINT功能性HCR内的几个短保守元件。我们对这些序列进行了不同的缺失,产生了缺少CE1ΔCE1突变体,实验表明缺乏CE1完全消除了LINC-PINT的作用和肿瘤形成


4

LINC-PINT抑制侵袭

   LINC-PINT的功能获得对癌细胞的侵袭能力具有强烈影响。为了确定所涉及的细胞途径,我们过表达并通过微阵列进行基因表达分析。其中233上调和301下调。差异基因富集到不同的生物学功能,最重要的是细胞发育,细胞运动和细胞生长和增殖。详细分析肿瘤细胞粘附网络时,我们发现与癌细胞迁移能力相关几个基因下调,如早期生长反应1EGR1),磷脂酶D1PLD1),白血病抑制因子(LIF) ,FBJ骨肉瘤癌基因(FOS),SERPINE1,纤连蛋白1FN1)或整合素α3ITGA3)。这些基因表达变化与细胞增殖和侵袭能力的降低一致,通过qRT-PCR独立验证


5

PRC2介导LINC-PINT依赖的侵袭基因沉默

我们研究LINC-PINT如何导致侵袭基因下调。有趣的是,当小鼠Lincpint在人体细胞中表达时,这种特征的几个基因也被下调,表明它们的抑制是由小鼠和人类形式共有的机制引起的。之前已经证明,LINC-PINT的小鼠转录本PRC2相互作用,并且它是通过这种蛋白质复合物有效靶向和抑制基因所必需的。然后我们通过检测PRC2免疫沉淀物中LINC-PINT的特异性富集,证实LINC-PINTPRC2在不同起源的人细胞中相互作用,包括正常细胞系和癌细胞系。我们假设LINC-PINT的活动可能至少部分与PRC2有关。然后,我们研究了由LINC-PINT诱导的这些基因所观察到的表达变化是否由PRC2介导。为了测试这一点,我们通过使用针对复合物的催化亚基EZH2shRNA抑制LINC-PINT过表达HCT116细胞中PRC2的表达,并通过qRT-PCR分析了几种基因的表达大多数基因的表达水平由PRC2敲低诱导,表明它们通过LINC-PINT的沉默是PRC2依赖性的。 ChIP-qPCR显示当LINC-PINT表达时SUZ12与所有启动子的结合显著增加。伴随着PRC2占据的增加,几乎所有分析的基因启动子(6/8)都显示出PRC2催化的表观遗传修饰H3K27me3的水平显著增加。总之,结果表明LINC-PINTPRC2共同作用以提高参与细胞侵袭基因的表达。

接下来,为了研究与PRC2的相互作用涉及LINC-PINT的哪个区域,我们在与甲醛(fRIP)交联并结合RNA组分后应用RIP。我们观察到CE1区域引物定位的最高浓度,表明LINC-PINT的这一部分介导其与PRC2的相互作用。最后,我们进一步测试了LINC-PINT在体外结合PRC2的能力是否依赖于CE1序列。为此,我们合成了LINC-PINT的不同突变形式,以及FL LINC-PINT和反义全长作为对照。结果证实,尽管高保守区是测试的RNA突变体中最短的,但全长LINC-PINT高保守区突变体以最高亲和力结合PRC2



讨 论

我们的数据显示LINC-PINTHCR)的截短序列包含抑制癌细胞迁移所必需的所有元素。此外,我们发现了一个短序列motifCE1),它在哺乳动物中高度保守并且是LINC-PINT功能所必需的。


结 论

我们的研究结果证明了LINC-PINT在癌症进展和肿瘤恶性肿瘤中下调。此外,它们支持LINC-PINTPRC2之间保守的功能性共依赖性,其抵消EGR1对基因的激活。它引导我们提出一种新的机制,lncRNA调节特定基因组区域附近的PRC2的可用性,表明lncRNADNA结合蛋白之间的相互作用可能与调节蛋白质-蛋白质相互作用相关。



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