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Ultraconserved element uc.372 drives hepatic lipid accumulation by suppressing miR-195/miR4668 maturation

文字:[大][中][小] 2018/10/26     浏览次数:    

Ultraconserved element uc.372 drives hepatic lipid accumulation by suppressing miR-195/miR4668 maturation

超保守lncRNA uc.372通过抑制miR-195/miR4668成熟来驱动肝脏脂质积聚


期刊:nature communications;影响因子:12.353

发表单位:北京医院


导 读

超保守(ucRNA是一类长的非编码RNAlncRNA),在人类,小鼠和大鼠中是保守的,但ucRNA的生理学意义和病理作用在很大程度上是未知的。此前介绍过两篇挑选超保守lncRNA,进行功能研究的文章RNAseq得到差异lncRNA那么多,该如何找到需要的lncRNA?”,作者根据lncRNA超保守区域找到一个lncRNA,在癌/睾丸中结合IGF2BP1形成复合物调控靶标基因表达的机制(cell;IF:31.398);“根据保守性挑选重要功能lncRNA”,lncRNA抑制miRNA生成促进靶基因表达进而引起肠上皮细胞快速更新(Gastroenterology;IF:20.773)。本研究同样筛选超保守lncRNA,发现uc.372可以抑制miR-195/miR-4668生成,促进靶基因(脂肪摄取、积聚相关基因)表达,驱动肝脏脂肪积累


研究背景

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的致病原因复杂且多样,目前研究主要集中在蛋白质编码基因上。越来越多的证据表明非编码RNA通过机制发挥重要的生物学,发育和病理作用,包括增强子的顺式调节,染色质重编程和转录后水平的mRNA加工。

LncRNAs,特别是高度保守的,被假定为经历主动调节并且可能具有细胞功能。一项全基因组调查确定481 lncRNA的长度超过200 bp,在人类,小鼠和大鼠基因组中具有100%的同一性。这些高度保守的lncRNA被称为超保守元件(UCEs)。超保守区域在DNA结合,RNA加工和转录中起关键作用。最近,已经表明转录的保守RNAucRNA)的表达模式在许多人类肿瘤中发生改变,表明它们可能参与癌症进展。本研究,我们提出了一种新的机制,uc.372通过抑制miR-195/miR-4668成熟来驱动肝脏脂肪变性,从而减轻miR-195/miR-4668介导的与脂质合成相关的功能性靶基因的抑制,包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC),脂肪酸合成酶(FAS),硬脂酰辅酶A去饱和酶1SCD1)和与脂质摄取相关的基因如CD36,导致肝脏脂质积累。


结 果

1

高脂肪饮食喂养的小鼠的肝脏中上调uc.372(筛选超保守,关键的上调的lnc)

为了鉴定可能参与肝脏脂质代谢的ucRNA,我们首先搜索了db/db小鼠肝脏中上调的ucRNA。 LncRNA范围的表达分析鉴定出16种ucRNA,在db/db小鼠的肝脏中异常增加~6.1至~30.4倍,伴有肝脏脂质积聚异常(图1a)。我们通过实时PCR分析db/db小鼠肝脏中5ucRNAuc.348uc.372uc.94uc.157uc.436)显著增加(n = 5)。此外,我们测定了高脂肪饮食(HFD)喂养小鼠肝脏中5 ucRNA的水平,发现uc.372,但不是uc.348uc.94uc.157uc.436的水平,在这些小鼠的肝脏中增加了4.4±0.4倍并伴随肝脏脂质积聚异常。接下来,通过分析uc.372在各种组织中的分布,我们发现uc.372在小鼠器官中广泛表达。在接受HFD的小鼠中,uc.372在代谢相关器官(包括肌肉,肝脏,心脏和脂肪)中的表达大量增加,意味着uc.372可能参与肝脏脂质代谢

2

uc.372驱动小鼠肝脏脂质积累(uc.372过表达,敲低验证表型变化)

接下来,我们假设肝脏uc.372上调可能导致异常的脂质积累。小鼠过表达uc.372Ad-中肝脏三甘油酯水平显著升高,肝脏重量,肝脏重量与体重的比例,血清胆固醇和甘油三酯水平显著增加。此外,我们通过northern印迹检测了过表达小鼠不同组织中uc.372的表达,发现肝脏中uc.372的高表达,但在其他组织中不表达。

敲低uc.372发现注射敲低小鼠的肝脏甘油三酯水平,肝脏重量,肝脏重量与体重的比率,血清胆固醇和甘油三酯水平显著降低


3

uc.372促进肝细胞中的脂质合成和摄取(uc.372过表达,敲低验证重要基因变化)

为了探索uc.372调节肝脏脂质代谢的潜在机制,过表达uc.372,评估了与脂质合成(ACCFASSCDSREBP1LXR),摄取(Fatp1Fatp2Fatp5Fabp1CD36),氧化(Cpt1aScadAcox1PPARα)和分泌(apoBMtp)相关的基因表达水平。我们发现,与对照细胞相比,过表达uc.372HepG2细胞,与脂质合成相关的基因(包括ACCFASSCD1)和与脂质摄取相关的基因(如CD36)的表达上调。类似地,小鼠肝脏中过表达uc.372导致accfasscd1cd36水平升高。

相反,敲低uc.372表达导致与脂质合成相关的基因ACCFASSCD1CD36mRNA和蛋白质水平低得多。此外,小鼠肝脏敲低uc.372降低了accfasscd1CD36的表达。这些结果表明,uc.372通过促进从头脂肪生成和脂质摄取来驱动肝脏脂肪积累。


4

uc.372抑制miR-195/miR-4668的成熟(探索uc.372作用机制

为了理解uc.372调节ACCFASSCD1CD36表达的机制,原位杂交分析uc.372细胞分布。uc.372主要定位于细胞核注,lnc的定位与功能相关)。uc.372表达的核/细胞质比率分别为12.613.3,表明uc.372可能在细胞核中发挥其生物学功能。miRNAsUCEs之间的相关性已被广泛报道,为了鉴定uc.372的潜在的miRNA靶标,我们在HepG2细胞中过表达uc.372并进行微阵列分析。阵列中存在的总共66miRNAuc.372转染时表现出≥1.5倍的上调或下调表达(过表达lnc后,做miRNA高通量筛选)。值得注意的是,pri-miR-195pri-miR-4668显示出与uc.372的超保守区域的互补性。

我们测定了uc.372抑制或过表达时pri-miR-195/pri-miR-4668pre-miR-195/pre-miR-4668miR-195/miR-4668的表达水平。uc.372的敲低观察到显著降低pri-miR-195/pri-miR-4668和升高pre-miR-195/pre-miR-4668和成熟的miR-195/miR-4668表达量。相反,uc.372的过表达增加了pri-miR-195/pri-miR-4668的水平并抑制了miR-195/miR-4668的成熟。为了破坏uc.372与这些miRNA之间的相互作用,我们构建了突变体。当该突变形式的uc.372过表达时,pri-miR-195/pri-miR-4668pre-miR-195/pre-miR-4668和成熟miR-195/miR-4668表达没有变化。用针对Drosha的抗体进行RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)测定,uc.372的过表达显著增加免疫沉淀的RNA中针对Drosha的抗体中pri-miR-195/pri-miR-4668的水平。

基于TargetScan,预测SCD1CD36可能是miR-4668的靶基因此处要挑选与脂肪形成相关的基因作为靶基因)。我们测定了用O/P混合物处理的HepG2细胞中miR-4668的表达,并且观察到与对照相比,O/P处理的HepG2细胞中miR-4668的表达降低(补充图6c)。为了证实SCD1CD36miR-4668的真正靶标,将含有miR-4668结合位点的这些基因的3'非翻译区(UTR)克隆到pmirGLO质粒中以评估荧光素酶活性。miR-4668显著抑制pmirGLO-SCD1-3'UTRpmirGLO-CD36-3'UTR的相对荧光素酶单位。 总之,这些数据证明uc.372通过结合pri-miR-195/pri-miR-4668特异性抑制miR-195/miR-4668表达以减轻miR-195/miR-4668介导的抑制。功能性靶基因如ACCFASSCD1CD36,导致肝细胞中的脂质积累。


5

INSM2可能参与uc.372的转录(寻找转录uc.372调节因子,丰富机制)

我们接下来试图了解uc.372的转录是如何被调节的。通过分析uc.372的序列,我们发现它由277个核苷酸(nt)组成,这些核苷酸在物种间高度保守。uc.372超保守区位于RALGAPA1基因的内含子区域内,并且位于14号染色体上胰岛素瘤相关2基因(INSM2)下游1400bp处。为了探索RALGAPA1INSM2uc.372转录之间可能的相互关系,首先通过实时PCRdb/db小鼠和HFD喂养的小鼠的肝脏中评估RALGAPA1INSM2mRNA水平。结果表明,在这些动物模型的肝脏中RALGAPA1INSM2的表达均增加。在用300μMO/ P混合物处理的HepG2细胞中,RALGAPA1INSM2mRNA水平也增强。此外,尽管RALGAPA1 mRNA水平降低了71-78%,但在用针对RALGAPA1siRNA转染的HepG2细胞中未鉴定出uc.372表达的变化。然而,在用靶向INSM2siRNA处理的HepG2细胞中,uc.372表达显著下调。这些观察结果表明INSM2可能参与了uc.372的转录调控。


6

USF1转录调节INSM2和uc.372表达(继续寻找调控uc.372表达的转录因子)

鉴于uc.372的转录依赖于INSM2,我们继续探索调节该过程的转录因子。通过基因调控数据库(http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html)确定了六种靶向uc.372的转录因子。如实时PCR分析所示,上游转录因子1USF1)的表达在db/dbHFD喂养的小鼠的肝脏中升高。我们还观察到用O/P混合物处理的HepG2细胞中USF1的水平显著增加。USF1INSM2的一致表达模式提高了USF1转录调节INSM2表达的可能性。过表达USF1的细胞显示出uc.372INSM2mRNA水平显著增强,但不显示NOX2的阴性对照。此外,USF1的过表达还导致ACCFASSCD1CD36的蛋白质水平显著增加。相反,降低USF1表达降低了uc.372INSM2mRNA水平,但没有降低NOX2的阴性对照和ACCFASSCD1CD36的蛋白质水平。uc.372的抑制显著减弱了USF1介导的ACCFASSCD1CD36表达的诱导。基于这些数据,我们提出USF1转录调节INSM2uc.372的表达,从而在肝细胞中表达ACCFASSCD1CD36的表达


7

uc.372的作用在NAFLD患者的肝脏中得到验证(使用人样品进行uc.372作用验证)

我们接下来通过调节pri-miR-195/pri-miR-4668处理,检查uc.372是否在功能上参与了NAFLD患者的异常肝脏脂质积聚。除了异常的脂质积累,我们还观察到NAFLD患者中肝uc.372表达的显著上调。微阵列转录组分析显示,NAFLD患者的肝脏中脂质代谢途径和uc.372表达异常改变。这促使我们使用实时PCR进一步检查与脂肪生成和脂质摄取相关的基因。我们确认在NAFLD患者的肝脏中ACCFASSCD1CD36的水平显著升高。一致地,我们发现肝INSM2USF1表达的显著增强,支持USF1转录调节NAFLD患者肝脏中INSM2uc.372表达的观点。随后,我们分析了这些患者中pri-miR-195/pri-miR-4668和成熟miR-195/miR-4668肝脏水平。有趣的是,我们观察到NAFLD患者肝脏中pri-miR-195/pri-miR-4668的增加和miR-195/miR-4668表达的减少。这些结果证实uc.372的脂质积累作用受NAFLD患者的脂肪肝中miR-195/miR-4668的调节(图8)。


讨 论

最近,ucRNA被鉴定为一类高度保守的lncRNAs,但是对ucRNAs的生理意义和潜在病理作用的清晰认识仍然是难以捉摸的。我们的发现揭示了一种新的机制,通过该机制,uc.372通过抑制miR-195/miR-4668的成熟来驱动肝脏脂肪变性,从而减轻靶基因的抑制,包括ACC ,FAS,SCD1和CD36。我们还提出uc.372抑制剂可能是NAFLD的潜在治疗药物。未来的主要目标是研究这种lncRNA在不同代谢相关器官中的潜在功能作用,以维持脂质体内平衡。



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