Ultraconserved element uc.372 drives hepatic lipid accumulation by suppressing miR-195/miR4668 maturation

超保守lncRNA uc.372通过抑制miR-195/miR4668成熟来驱动肝脏脂质积聚

期刊：nature communications；影响因子：12.353

发表单位：北京医院

超保守（uc）RNA是一类长的非编码RNA（lncRNA），在人类，小鼠和大鼠中是保守的，但ucRNA的生理学意义和病理作用在很大程度上是未知的。此前介绍过两篇挑选超保守lncRNA，进行功能研究的文章“RNAseq得到差异lncRNA那么多，该如何找到需要的lncRNA?”，作者根据lncRNA超保守区域找到一个lncRNA，在癌/睾丸中结合IGF2BP1形成复合物调控靶标基因表达的机制（cell；IF：31.398）；“根据保守性挑选重要功能lncRNA”，lncRNA抑制miRNA生成促进靶基因表达进而引起肠上皮细胞快速更新(Gastroenterology；IF：20.773)。本研究同样筛选超保守lncRNA,发现uc.372可以抑制miR-195/miR-4668生成，促进靶基因（脂肪摄取、积聚相关基因）表达，驱动肝脏脂肪积累。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的致病原因复杂且多样，目前研究主要集中在蛋白质编码基因上。越来越多的证据表明非编码RNA通过机制发挥重要的生物学，发育和病理作用，包括增强子的顺式调节，染色质重编程和转录后水平的mRNA加工。

LncRNAs，特别是高度保守的，被假定为经历主动调节并且可能具有细胞功能。一项全基因组调查确定481 lncRNA的长度超过200 bp，在人类，小鼠和大鼠基因组中具有100％的同一性。这些高度保守的lncRNA被称为超保守元件（UCEs）。超保守区域在DNA结合，RNA加工和转录中起关键作用。最近，已经表明转录的超保守RNA（ucRNA）的表达模式在许多人类肿瘤中发生改变，表明它们可能参与癌症进展。本研究，我们提出了一种新的机制，uc.372通过抑制miR-195/miR-4668成熟来驱动肝脏脂肪变性，从而减轻miR-195/miR-4668介导的与脂质合成相关的功能性靶基因的抑制，包括乙酰辅酶A羧化酶（ACC），脂肪酸合成酶（FAS），硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）和与脂质摄取相关的基因如CD36，导致肝脏脂质积累。

为了鉴定可能参与肝脏脂质代谢的ucRNA，我们首先搜索了db/db小鼠肝脏中上调的ucRNA。 LncRNA范围的表达分析鉴定出16种ucRNA，在db/db小鼠的肝脏中异常增加~6.1至~30.4倍，伴有肝脏脂质积聚异常（图1a）。我们通过实时PCR分析db/db小鼠肝脏中5个ucRNA（uc.348，uc.372，uc.94，uc.157和uc.436）显著增加（n = 5）。此外，我们测定了高脂肪饮食（HFD）喂养小鼠肝脏中5 ucRNA的水平，发现uc.372，但不是uc.348，uc.94，uc.157和uc.436的水平，在这些小鼠的肝脏中增加了4.4±0.4倍并伴随肝脏脂质积聚异常。接下来，通过分析uc.372在各种组织中的分布，我们发现uc.372在小鼠器官中广泛表达。在接受HFD的小鼠中，uc.372在代谢相关器官（包括肌肉，肝脏，心脏和脂肪）中的表达大量增加，意味着uc.372可能参与肝脏脂质代谢。

接下来，我们假设肝脏uc.372上调可能导致异常的脂质积累。小鼠过表达uc.372，Ad-中肝脏三甘油酯水平显著升高，肝脏重量，肝脏重量与体重的比例，血清胆固醇和甘油三酯水平显著增加。此外，我们通过northern印迹检测了过表达小鼠不同组织中uc.372的表达，发现肝脏中uc.372的高表达，但在其他组织中不表达。

敲低uc.372发现注射敲低小鼠的肝脏甘油三酯水平，肝脏重量，肝脏重量与体重的比率，血清胆固醇和甘油三酯水平显著降低。

为了探索uc.372调节肝脏脂质代谢的潜在机制，过表达uc.372，评估了与脂质合成（ACC，FAS，SCD，SREBP1和LXR），摄取（Fatp1，Fatp2，Fatp5，Fabp1和CD36），氧化（Cpt1a，Scad，Acox1和PPARα）和分泌（apoB和Mtp）相关的基因表达水平。我们发现，与对照细胞相比，过表达uc.372的HepG2细胞，与脂质合成相关的基因（包括ACC，FAS和SCD1）和与脂质摄取相关的基因（如CD36）的表达上调。类似地，小鼠肝脏中过表达uc.372导致acc，fas，scd1和cd36水平升高。

相反，敲低uc.372表达导致与脂质合成相关的基因ACC，FAS，SCD1和CD36的mRNA和蛋白质水平低得多。此外，小鼠肝脏敲低uc.372降低了acc，fas，scd1和CD36的表达。这些结果表明，uc.372通过促进从头脂肪生成和脂质摄取来驱动肝脏脂肪积累。

为了理解uc.372调节ACC，FAS，SCD1和CD36表达的机制，原位杂交分析uc.372细胞分布。uc.372主要定位于细胞核（注，lnc的定位与功能相关）。uc.372表达的核/细胞质比率分别为12.6和13.3，表明uc.372可能在细胞核中发挥其生物学功能。miRNAs和UCEs之间的相关性已被广泛报道，为了鉴定uc.372的潜在的miRNA靶标，我们在HepG2细胞中过表达uc.372并进行微阵列分析。阵列中存在的总共66种miRNA在uc.372转染时表现出≥1.5倍的上调或下调表达（过表达lnc后，做miRNA高通量筛选）。值得注意的是，pri-miR-195和pri-miR-4668显示出与uc.372的超保守区域的互补性。

我们测定了uc.372抑制或过表达时pri-miR-195/pri-miR-4668，pre-miR-195/pre-miR-4668和miR-195/miR-4668的表达水平。uc.372的敲低观察到显著降低了pri-miR-195/pri-miR-4668和升高了pre-miR-195/pre-miR-4668和成熟的miR-195/miR-4668表达量。相反，uc.372的过表达增加了pri-miR-195/pri-miR-4668的水平并抑制了miR-195/miR-4668的成熟。为了破坏uc.372与这些miRNA之间的相互作用，我们构建了突变体。当该突变形式的uc.372过表达时，pri-miR-195/pri-miR-4668，pre-miR-195/pre-miR-4668和成熟miR-195/miR-4668表达没有变化。用针对Drosha的抗体进行RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）测定，uc.372的过表达显著增加免疫沉淀的RNA中针对Drosha的抗体中pri-miR-195/pri-miR-4668的水平。

基于TargetScan，预测SCD1和CD36可能是miR-4668的靶基因（此处要挑选与脂肪形成相关的基因作为靶基因）。我们测定了用O/P混合物处理的HepG2细胞中miR-4668的表达，并且观察到与对照相比，O/P处理的HepG2细胞中miR-4668的表达降低（补充图6c）。为了证实SCD1和CD36是miR-4668的真正靶标，将含有miR-4668结合位点的这些基因的3'非翻译区（UTR）克隆到pmirGLO质粒中以评估荧光素酶活性。miR-4668显著抑制pmirGLO-SCD1-3'UTR或pmirGLO-CD36-3'UTR的相对荧光素酶单位。 总之，这些数据证明uc.372通过结合pri-miR-195/pri-miR-4668特异性抑制miR-195/miR-4668表达以减轻miR-195/miR-4668介导的抑制。功能性靶基因如ACC，FAS，SCD1和CD36，导致肝细胞中的脂质积累。

我们接下来试图了解uc.372的转录是如何被调节的。通过分析uc.372的序列，我们发现它由277个核苷酸（nt）组成，这些核苷酸在物种间高度保守。uc.372超保守区位于RALGAPA1基因的内含子区域内，并且位于14号染色体上胰岛素瘤相关2基因（INSM2）下游1400bp处。为了探索RALGAPA1，INSM2和uc.372转录之间可能的相互关系，首先通过实时PCR在db/db小鼠和HFD喂养的小鼠的肝脏中评估RALGAPA1和INSM2的mRNA水平。结果表明，在这些动物模型的肝脏中RALGAPA1和INSM2的表达均增加。在用300μMO/ P混合物处理的HepG2细胞中，RALGAPA1和INSM2的mRNA水平也增强。此外，尽管RALGAPA1 mRNA水平降低了71-78％，但在用针对RALGAPA1的siRNA转染的HepG2细胞中未鉴定出uc.372表达的变化。然而，在用靶向INSM2的siRNA处理的HepG2细胞中，uc.372表达显著下调。这些观察结果表明INSM2可能参与了uc.372的转录调控。

鉴于uc.372的转录依赖于INSM2，我们继续探索调节该过程的转录因子。通过基因调控数据库（http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html）确定了六种靶向uc.372的转录因子。如实时PCR分析所示，上游转录因子1（USF1）的表达在db/db和HFD喂养的小鼠的肝脏中升高。我们还观察到用O/P混合物处理的HepG2细胞中USF1的水平显著增加。USF1与INSM2的一致表达模式提高了USF1转录调节INSM2表达的可能性。过表达USF1的细胞显示出uc.372和INSM2的mRNA水平显著增强，但不显示NOX2的阴性对照。此外，USF1的过表达还导致ACC，FAS，SCD1和CD36的蛋白质水平显著增加。相反，降低USF1表达降低了uc.372和INSM2的mRNA水平，但没有降低NOX2的阴性对照和ACC，FAS，SCD1和CD36的蛋白质水平。uc.372的抑制显著减弱了USF1介导的ACC，FAS，SCD1和CD36表达的诱导。基于这些数据，我们提出USF1转录调节INSM2和uc.372的表达，从而在肝细胞中表达ACC，FAS，SCD1和CD36的表达。

我们接下来通过调节pri-miR-195/pri-miR-4668处理，检查uc.372是否在功能上参与了NAFLD患者的异常肝脏脂质积聚。除了异常的脂质积累，我们还观察到NAFLD患者中肝uc.372表达的显著上调。微阵列转录组分析显示，NAFLD患者的肝脏中脂质代谢途径和uc.372表达异常改变。这促使我们使用实时PCR进一步检查与脂肪生成和脂质摄取相关的基因。我们确认在NAFLD患者的肝脏中ACC，FAS，SCD1和CD36的水平显著升高。一致地，我们发现肝INSM2和USF1表达的显著增强，支持USF1转录调节NAFLD患者肝脏中INSM2和uc.372表达的观点。随后，我们分析了这些患者中pri-miR-195/pri-miR-4668和成熟miR-195/miR-4668的肝脏水平。有趣的是，我们观察到NAFLD患者肝脏中pri-miR-195/pri-miR-4668的增加和miR-195/miR-4668表达的减少。这些结果证实uc.372的脂质积累作用受NAFLD患者的脂肪肝中miR-195/miR-4668的调节（图8）。

最近，ucRNA被鉴定为一类高度保守的lncRNAs，但是对ucRNAs的生理意义和潜在病理作用的清晰认识仍然是难以捉摸的。我们的发现揭示了一种新的机制，通过该机制，uc.372通过抑制miR-195/miR-4668的成熟来驱动肝脏脂肪变性，从而减轻靶基因的抑制，包括ACC ，FAS，SCD1和CD36。我们还提出uc.372抑制剂可能是NAFLD的潜在治疗药物。未来的主要目标是研究这种lncRNA在不同代谢相关器官中的潜在功能作用，以维持脂质体内平衡。

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