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Long Noncoding RNA uc.173 Promotes Renewal of the Intestinal Mucosa by Inducing Degradation of MicroRNA195

文字:[大][中][小] 2018/10/26     浏览次数:    

Long Noncoding RNA uc.173 Promotes Renewal of the Intestinal Mucosa by Inducing Degradation of MicroRNA195

长非编码RNA uc.173通过诱导MicroRNA-195的降解促进肠粘膜的更新


    期刊:Gastroenterology;影响因子:20.773        

    发表单位:马里兰大学医学院

导 读

      lncRNA普遍保守性较低,RNAseq鉴定lncRNA时会发现一些保守程度极高或者具有超保守区域的lncRNA。这种高度进化保守区域可能在生理学,疾病等方面具有重要作用。之前一篇文章“RNAseq得到差异lncRNA那么多,该如何找到需要的lncRNA?”中介绍了作者根据lncRNA超保守区域找到一个  lncRNA,在癌/睾丸中结合IGF2BP1形成复合物调控靶标基因表达的机制。本研究同样筛选处理组差异表达的超保守lncRNA,发现lncRNA uc.173表达上调,过表达uc.173显著促进肠上皮细胞增殖,敲低uc.173抑制肠上皮细胞增殖,提示其在肠粘膜更新中发挥重要功能。机制研究发现,uc.173可以抑制miRNA195稳定性,促进其降解,进而促进细胞增殖。


研究背景

哺乳动物肠粘膜上皮在整个生命体内经历快速和持续的更新,并作为管腔微生物群和身体之间的物理屏障。人类小肠上皮细胞每天经历大约1011个有丝分裂,这种快速周转率受到多种细胞内和细胞外因子的严密控制,以维持组织稳态。长非编码RNAlncRNA)被定义为跨越> 200nt长度的转录RNA,其控制基因表达的每个水平,包括染色质重塑,转录和转录后过程以及蛋白质代谢。lncRNAs可以是前体miRNApri-miRNA),作为miRNA的分子海绵,和/或控制pri-miRNA加工。超保守区域(UCR)代表人类基因组的保守序列,它们可能具有功能,但是不编码蛋白质,因此被称为人类基因组的暗物质。从UCRT-UCRs)转录的RNA是一类有趣的lncRNA,因为它起源于基因内或基因间区域的基因组元件,在许多哺乳动物基因组中具有接近完美的进化保守性。



结 果

1

查找肠粘膜生长过程中T-UCR

为了确定T-UCR在肠粘膜生长调节中的作用,将食物饥饿诱导的粘膜萎缩用作模型,并进行基于微阵列的全局T-UCR表达谱的筛选。禁食48小时抑制了小鼠的小肠粘膜生长。表达谱的比较显示21T-UCR差异表达,禁食48小时的小鼠中18T-UCR包括uc.481uc.356uc.173等表达减少,而3T-UCR包括uc.457uc.477uc.457表达增加(图1AB)。

我们专注于uc.173因为抑制粘膜生长后其表达量变化强烈,基于miRNA预测,uc.173与包括miRNA195在内的几种miRNA存在潜在的相互作用。此外,uc.173表达基础水平比其他T-UCR的基础水平。而后qPCR验证,证实48小时的禁食显著降低了小肠粘膜中的uc.173水平。对Caco-2细胞的分析进一步表明,通过用DFMODL-α-二氟甲基鸟氨酸)耗尽细胞多胺来抑制细胞增殖也与细胞水平的降低有关。DFMO处理4天几乎完全耗尽细胞多胺并导致Caco-2细胞经历G1期生长停滞。与DFMO一起给予的外源性聚胺腐胺拯救了uc.173表达并恢复了细胞增殖。


2

uc.173肠粘膜生长作用(lncRNA过表达,敲低功能验证)


为了确定uc.173在控制肠上皮细胞更新中的功能。我们过表达uc.173水平检测对Caco-2细胞生长和从小鼠中小肠分离的培养的orga-noids的影响。在Caco-2细胞中,过表达uc.173水平,与对照载体转染的细胞相比,uc.173的高表达增加了细胞数量。离体模型中,过表达uc.173刺激了肠类器官的生长。引人注目的是,通过增加的BrdU掺入确定,uc.173的高表达显著激活了多个细胞中的DNA合成,并增强了肠类器官的表面积。在uc.173过表达后,每个类器官的细胞数量也增加。这些结果表明,增加uc.173的水平促进肠上皮细胞的生长。

其次,使用LNA修饰的寡聚体沉默uc.173是否会抑制肠粘膜的生长。Caco-2细胞敲低uc.173水平抑制了IEC的增殖,为了排除脱靶效应,测试了2种抗uc.173寡核苷酸,抗uc.173_1和抗uc.173_2,显示出相似的结果。我们还检测了uc.173沉默对IEC-6细胞增殖的影响。与在Caco-2细胞中观察到的相似,通过转染抗-uc.173_1降低uc.173水平也抑制了IEC-6细胞的增殖

此外,uc.173沉默增加了p53的丰度但降低了CDK4蛋白的水平。在暴露于uc.173拮抗作用的小鼠中,粘膜中细胞增殖标志物PCNA21的水平也降低。有趣的是,从克罗恩病患者获得的肠粘膜组织显示出与对照组(无粘膜损伤或炎症组)中观察到的uc.173水平显著降低。粘膜uc.173的水平降低与细胞增殖标志物Ki67的降低相关。总之,研究结果强烈支持uc.173是肠上皮体内稳态的关键调节因子,其诱导增强小肠粘膜的生长。


3

uc.173特异性抑制miRNA195表达(机制研究)


为了测试uc.173是否通过调节miRNA功能刺激肠粘膜生长,我们检测了改变uc.173水平对Caco-2细胞中几种miRNA(包括miRNA29bmiRNA195miRNA222miRNA503)水平的影响。我们专注于这组选择的miRNA,因为它们的基础水平在肠粘膜中相对较高,并且发现其表达水平的变化改变肠粘膜再生敲低uc.173增强了miRNA195的表达,与对照相比,成熟miRNA195的水平在uc.173敲低细胞中增加。另一方面,过表达uc.173降低了miRNA195表达水平。有趣的是,uc.173敲低也增加了miRNA195的前体转录本pri-miR-195的水平,而过表达uc.173的水平降低了pri-miR-195的丰度。降低小肠粘膜中的uc.173水平也增加了小鼠中的miRNA195水平。

为了确定uc.173是否在转录水平抑制miRNA195表达,我们检测了uc.173沉默后转录因子JunDp53水平的变化。JunDp53刺激编码pri-miRNA转录本的几种基因的转录,并且在miR-195启动子中鉴定出JunDAP-1)和p53的潜在结合位点。敲低uc.173增加了JunDp53的水平。接下来,我们从人基因组DNA克隆miRNA195启动子,然后将其亚克隆到荧光素酶报道载体中。出乎意料的是,敲低uc.173不改变Caco-2IEC-6细胞的miRNA195启动子活性。一致地,对照和过表达uc.173的细胞之间miRNA195启动子活性水平没有显著差异。结果表明uc.173通过其他的机制而不是其基因转录抑制miRNA195的表达。


4

uc.173与pri-miR-195转录本相互作用并使其不稳定(机制进一步确定)


    Pri-miR-195显示与位于pri-miR-195的中心茎区的7个核苷酸处的uc.173完全互补(图6A)。为了测试这两种ncRNA之间是否存在直接相互作用,使用生物素化的pri-miR-195进行RNA下拉测定。使用biot-pri-miR-195下拉的样品中的uc.173水平远高于对照。uc.173pri-miR-195的这种直接关联是特异性的,因为生物素标记的pri-miRNA195未能降低uc.346uc.283。成熟的miRNA195uc.173不是互补的,也没有下调uc.173。我们进一步检查了uc.173过表达后pri-miR-195稳定性的变化,发现异常表达的uc.173增强了pri-miR-195的降解。与用对照载体转染的细胞相比,过量表达uc.173的细胞中pri-miR-195的半衰期显著降低。结果表明uc.173主要通过使pri-miR-195转录本去稳定来抑制miRNA195表达。

我们的结果进一步揭示了uc.173介导的miRNA195抑制对于控制IEC增殖至关重要。通过uc.173沉默增加内源miRNA195的水平抑制细胞增殖,并且这种效应几乎完全通过miRNA195 antagomir的异常转染来挽救。相反,过表达uc.173对细胞增殖的刺激通过转染miRNA195前体(pre-miR-195)增加细胞miRNA195的水平而被抑制。事实上,与pre-miR-195uc.173表达载体共转染后的细胞数低于用对照载体转染的细胞中的细胞数。总之,我们的发现提出了一种新模型,其中uc.173通过pri-miR-195中的转录后减少来下调miRNA195表达来刺激肠上皮细胞更新。该过程通过直接RNA-RNA相互作用来实现,所述相互作用增强pri-miR-195转录本的降解。


讨 论

我们在基因组水平上研究了一类新的lncRNA,即T-UCR我们鉴定了在抑制肠粘膜生长期间差异表达的许多T-UCR,并证明T-UCR uc.173作为肠粘膜更新的生物刺激物起作用。我们的结果进一步揭示了uc.173通过使pri-miR-195转录本去稳定来增强肠粘膜的生长。这些发现代表了将T-UCR与肠粘膜更新联系起来的主要概念进展,并揭示了uc.173 / miRNA195轴对肠粘膜萎缩和适应不良的发病机制的重要影响。

uc.173通过稳定pri-miR-195转录本而不影响其基因转录来下调IEC中的miRNA195uc.173直接与pri-miR-195相互作用并且特异性地增强其降解。

uc.173介导的miRNA195抑制具有生物学意义,可能提供创新的分子疗法,以保护患有严重疾病的患者的粘膜上皮完整性。总之,我们的结果表明uc.173通过降低miRNA195丰度而作为肠粘膜更新的有效刺激物起作用。我们的研究还表明,通过RNA-RNA相互作用对pri-miRNA转换的调节控制代表了增强肠上皮再生的新型治疗靶标。



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