Long Noncoding RNA uc.173 Promotes Renewal of the Intestinal Mucosa by Inducing Degradation of MicroRNA195

长非编码RNA uc.173通过诱导MicroRNA-195的降解促进肠粘膜的更新

    期刊：Gastroenterology；影响因子：20.773        

    发表单位：马里兰大学医学院

哺乳动物肠粘膜上皮在整个生命体内经历快速和持续的更新，并作为管腔微生物群和身体之间的物理屏障。人类小肠上皮细胞每天经历大约10¹¹个有丝分裂，这种快速周转率受到多种细胞内和细胞外因子的严密控制，以维持组织稳态。长非编码RNA（lncRNA）被定义为跨越> 200nt长度的转录RNA，其控制基因表达的每个水平，包括染色质重塑，转录和转录后过程以及蛋白质代谢。lncRNAs可以是前体miRNA（pri-miRNA），作为miRNA的分子海绵，和/或控制pri-miRNA加工。超保守区域（UCR）代表人类基因组的保守序列，它们可能具有功能，但是不编码蛋白质，因此被称为人类基因组的“暗物质”。从UCR（T-UCRs）转录的RNA是一类有趣的lncRNA，因为它起源于基因内或基因间区域的基因组元件，在许多哺乳动物基因组中具有接近完美的进化保守性。

为了确定T-UCR在肠粘膜生长调节中的作用，将食物饥饿诱导的粘膜萎缩用作模型，并进行基于微阵列的全局T-UCR表达谱的筛选。禁食48小时抑制了小鼠的小肠粘膜生长。表达谱的比较显示21个T-UCR差异表达，禁食48小时的小鼠中18种T-UCR包括uc.481，uc.356，uc.173等表达减少，而3种T-UCR包括uc.457，uc.477和uc.457表达增加（图1A，B）。

我们专注于uc.173，因为抑制粘膜生长后其表达量变化强烈，基于miRNA预测，uc.173与包括miRNA195在内的几种miRNA存在潜在的相互作用。此外，uc.173表达基础水平比其他T-UCR的基础水平高。而后qPCR验证，证实48小时的禁食显著降低了小肠粘膜中的uc.173水平。对Caco-2细胞的分析进一步表明，通过用DFMO（D，L-α-二氟甲基鸟氨酸）耗尽细胞多胺来抑制细胞增殖也与细胞水平的降低有关。DFMO处理4天几乎完全耗尽细胞多胺并导致Caco-2细胞经历G1期生长停滞。与DFMO一起给予的外源性聚胺腐胺拯救了uc.173表达并恢复了细胞增殖。

为了确定uc.173在控制肠上皮细胞更新中的功能。我们过表达uc.173水平检测对Caco-2细胞生长和从小鼠中小肠分离的培养的orga-noids的影响。在Caco-2细胞中，过表达uc.173水平，与对照载体转染的细胞相比，uc.173的高表达增加了细胞数量。离体模型中，过表达uc.173刺激了肠类器官的生长。引人注目的是，通过增加的BrdU掺入确定，uc.173的高表达显著激活了多个细胞中的DNA合成，并增强了肠类器官的表面积。在uc.173过表达后，每个类器官的细胞数量也增加。这些结果表明，增加uc.173的水平促进肠上皮细胞的生长。

其次，使用LNA修饰的寡聚体沉默uc.173是否会抑制肠粘膜的生长。Caco-2细胞敲低uc.173水平抑制了IEC的增殖，为了排除脱靶效应，测试了2种抗uc.173寡核苷酸，抗uc.173_1和抗uc.173_2，显示出相似的结果。我们还检测了uc.173沉默对IEC-6细胞增殖的影响。与在Caco-2细胞中观察到的相似，通过转染抗-uc.173_1降低uc.173水平也抑制了IEC-6细胞的增殖。

此外，uc.173沉默增加了p53的丰度但降低了CDK4蛋白的水平。在暴露于uc.173拮抗作用的小鼠中，粘膜中细胞增殖标志物PCNA21的水平也降低。有趣的是，从克罗恩病患者获得的肠粘膜组织显示出与对照组（无粘膜损伤或炎症组）中观察到的uc.173水平显著降低。粘膜uc.173的水平降低与细胞增殖标志物Ki67的降低相关。总之，研究结果强烈支持uc.173是肠上皮体内稳态的关键调节因子，其诱导增强小肠粘膜的生长。

为了测试uc.173是否通过调节miRNA功能刺激肠粘膜生长，我们检测了改变uc.173水平对Caco-2细胞中几种miRNA（包括miRNA29b，miRNA195，miRNA222和miRNA503）水平的影响。我们专注于这组选择的miRNA，因为它们的基础水平在肠粘膜中相对较高，并且发现其表达水平的变化改变肠粘膜再生。敲低uc.173增强了miRNA195的表达，与对照相比，成熟miRNA195的水平在uc.173敲低细胞中增加。另一方面，过表达uc.173降低了miRNA195表达水平。有趣的是，uc.173敲低也增加了miRNA195的前体转录本pri-miR-195的水平，而过表达uc.173的水平降低了pri-miR-195的丰度。降低小肠粘膜中的uc.173水平也增加了小鼠中的miRNA195水平。

为了确定uc.173是否在转录水平抑制miRNA195表达，我们检测了uc.173沉默后转录因子JunD和p53水平的变化。JunD和p53刺激编码pri-miRNA转录本的几种基因的转录，并且在miR-195启动子中鉴定出JunD（AP-1）和p53的潜在结合位点。敲低uc.173增加了JunD和p53的水平。接下来，我们从人基因组DNA克隆miRNA195启动子，然后将其亚克隆到荧光素酶报道载体中。出乎意料的是，敲低uc.173不改变Caco-2和IEC-6细胞的miRNA195启动子活性。一致地，对照和过表达uc.173的细胞之间miRNA195启动子活性水平没有显著差异。结果表明uc.173通过其他的机制而不是其基因转录抑制miRNA195的表达。

    Pri-miR-195显示与位于pri-miR-195的中心茎区的7个核苷酸处的uc.173完全互补（图6A）。为了测试这两种ncRNA之间是否存在直接相互作用，使用生物素化的pri-miR-195进行RNA下拉测定。使用biot-pri-miR-195下拉的样品中的uc.173水平远高于对照。uc.173与pri-miR-195的这种直接关联是特异性的，因为生物素标记的pri-miRNA195未能降低uc.346或uc.283。成熟的miRNA195与uc.173不是互补的，也没有下调uc.173。我们进一步检查了uc.173过表达后pri-miR-195稳定性的变化，发现异常表达的uc.173增强了pri-miR-195的降解。与用对照载体转染的细胞相比，过量表达uc.173的细胞中pri-miR-195的半衰期显著降低。结果表明uc.173主要通过使pri-miR-195转录本去稳定来抑制miRNA195表达。

我们的结果进一步揭示了uc.173介导的miRNA195抑制对于控制IEC增殖至关重要。通过uc.173沉默增加内源miRNA195的水平抑制细胞增殖，并且这种效应几乎完全通过miRNA195 antagomir的异常转染来挽救。相反，过表达uc.173对细胞增殖的刺激通过转染miRNA195前体（pre-miR-195）增加细胞miRNA195的水平而被抑制。事实上，与pre-miR-195和uc.173表达载体共转染后的细胞数低于用对照载体转染的细胞中的细胞数。总之，我们的发现提出了一种新模型，其中uc.173通过pri-miR-195中的转录后减少来下调miRNA195表达来刺激肠上皮细胞更新。该过程通过直接RNA-RNA相互作用来实现，所述相互作用增强pri-miR-195转录本的降解。

我们在基因组水平上研究了一类新的lncRNA，即T-UCR我们鉴定了在抑制肠粘膜生长期间差异表达的许多T-UCR，并证明T-UCR uc.173作为肠粘膜更新的生物刺激物起作用。我们的结果进一步揭示了uc.173通过使pri-miR-195转录本去稳定来增强肠粘膜的生长。这些发现代表了将T-UCR与肠粘膜更新联系起来的主要概念进展，并揭示了uc.173 / miRNA195轴对肠粘膜萎缩和适应不良的发病机制的重要影响。

uc.173通过稳定pri-miR-195转录本而不影响其基因转录来下调IEC中的miRNA195。uc.173直接与pri-miR-195相互作用并且特异性地增强其降解。

uc.173介导的miRNA195抑制具有生物学意义，可能提供创新的分子疗法，以保护患有严重疾病的患者的粘膜上皮完整性。总之，我们的结果表明uc.173通过降低miRNA195丰度而作为肠粘膜更新的有效刺激物起作用。我们的研究还表明，通过RNA-RNA相互作用对pri-miRNA转换的调节控制代表了增强肠上皮再生的新型治疗靶标。

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